Материал: Иммунология методические указания по выполнению лабораторных работ для студентов специальности 36.05.01 Ветеринария

ТЕМА 2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОРА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА ЖИВОТНЫХ

Цель: техника постановки ОРА с набором комплексных и моновалентных сальмонеллѐзных сывороток

На первом этапе ставится ОРА с групповыми О-сыворотками, которые объединены в 8 комплексов и обозначаются цифрами. По двум положительно среагировавшим комплексам определяют групповую О-сыворотку, имеющую сродство к данному микроорганизму. Групповая О-сыворотка указывает в инструкции на серогруппу, которая обозначается прописной буквой латинского алфавита.

На втором этапе ОРА ставят моновалентными сальмонеллѐзными Н-сыворотками. Сначала с Н-сыворотками 1-й фазы, а затем, если это необходимо, 2-й фазы, указанными в инструкции. Н-сыворотки позволяют определить серовариант сальмонелл внутри серогруппы.

Принцип метода. Склеивание корпускулярного антигена антителами диагностической гипериммунной агглютинирующей сыворотки.

Ход анализа.

1.Каждому студенту провести ОРА с одной комплексной сальмонеллѐзной диагностической гипериммунной агглютинирующей сывороткой для определения серогруппы выданной на группу студентов культуры сальмонелл.

2.Результаты ОРА зафиксировать в тетради.

3.Сопоставив результаты всех студентов группы сделать заключение по серогрупповой принадлежности сальмонеллы.

4.Каждому студенту провести ОРА с одной моновалентной сальмонеллѐзной Н-сывороткой (из указанных в инструкции для данной серогруппы) для определения сероварианта выданной на группу студентов культуры сальмонелл.

Оборудование и биологические объекты

1.Взвесь убитой культуры сальмонелл.

2.Набор диагностических гипериммунных агглютинирующих сальмонеллѐзных сывороток с инструкцией.

3.Стѐкла для ОРА.

4.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / Кисленко, В. Н. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

6

ТЕМА 3. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)

Цель: техника постановки РНГА с эритроцитарным антигенным диагностикум

Реакцию ставят в пластиковых плашках.

Исследуемую сыворотку разводят до исходного разведения 1:50. В ряд из 12-и лунок вносят по 0.4 мл физиологического раствора. Затем в 1-ю лунку вносят 0.4 мл исходного разведения сыворотки и титруют еѐ в последующих лунках ряда, перенося из лунки в лунку по 0.4 мл содержимого. Из последней лунки 0.4 мл содержимого удаляют. Таким образом, общий объѐм содержимого лунок составляет 0.4 мл с разведениями сыворотки: 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800, 1:25600, 1:51200, 1:102400, 1:204800. В каждую лунку ряда вносят по 0.05 мл 2.5%-й

взвеси эритроцитарного антигенного диагностикума.

Содержимое лунок перемешивают встряхиванием плашки и инкубируют при 37◦С в течение 2.5 часов.

Параллельно ставят "+" и "-" контроли.

Учѐт результатов начинают с контрольных рядов лунок. Результат реакции оценивается в четырѐх крестовой системе:

«++++» - эритроциты на дне лунки в виде «перевѐрнутого зонтика»; «-» - эритроциты на дне лунки в виде «пуговки».

Результат реакции на «++++» и «+++» считают положительным. Максимальное разведение исследуемой сыворотки крови с положительным результатом называют титром сыворотки в РНГА.

Принцип метода. Склеивание эритроцитарного антигенного диагностика антителами сыворотки больного животного.

Ход анализа.

1.Каждому студенту провести РНГА с одной из предложенных сывороток животных.

2.Результаты РНГА зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1.Исследуемые сыворотки животных.

2.Эритроцитарный антигенный диагностикум.

3.Физиологический раствор.

4.Пластиковых плашки.

5.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

6.Стеклянные градуированные пипетки на 1 мл.

7.Резиновые груши.

8.Штативы для пробирок.

9.Стѐкла для накрывания плашек.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / В. Н. Кисленко. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

7

ТЕМА 4. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

4.1ПРИНЦИП РЕАКЦИИ. ТИТРАЦИЯ ГЕМОЛИЗИНА И КОМПЛЕМЕНТА Цель: техника постановки РСК

Вреакции участвуют две системы: 1) бактериолитическая; 2) гемолитическая.

Вбактериолитическую систему входят антиген, исследуемая сыворотка крови, в гемолитическую – гемолизин и эритроциты барана. Комплемент может входить в любую систему.

Принцип реакции следующий. Если произошло образование комплекса «антигенантитело», то комплемент связывается с ним. Если комплекса «антиген-антитело» нет, то свободный комплемент способствует разрушению (гемолизу) эритроцитов гемолизином.

Для постановки РСК необходим ряд компонентов.

1. Коммерческий антиген в разведении, указанном на флаконе.

2. Исследуемая сыворотка крови, разведѐнная 1:10 и инактивированная нагреванием. 3. Гемолизин в рабочем титре.

4. Комплемент сыворотки крови морской свинки в соответствующем титре.

5.Взвесь отмытых эритроцитов барана в разведении 1:40 на физиологическом растворе.

6.Физиологический раствор.

Титрация гемолизина

В верхнем ряду пробирок готовится ряд последовательных пятисот кратных разведения гемолизина (табл. 1).

8

Нижний ряд пробирок инкубируют при 37◦С 15 минут. Учѐт начинают с первой пробирки. За предельный титр гемолизина принимаем наибольшее разведение его с полным гемолизом. За рабочий титр гемолизина принимают уменьшенный вдвое предельный титр.

Параллельно ставят отрицательные контроли комплемента и гемолизина.

Ряд пробирок инкубируют при 37◦С 15 минут. Учѐт начинают с последней пробирки. Титром комплемента считают наименьшее его количество, обеспечивающее полный гемолиз.

Параллельно ставят отрицательные контроли комплемента и гемолизина.

9

Принцип метода. Разрушение эритроцитов барана при совместном действии комплемента и гемолизина.

Ход анализа.

1.Студентам разделится на две группы.

2.1-й группе провести титрацию гемолизина.

3.2-й группе провести титрацию гемолизина.

4.Результаты титрации зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1.Гемолизин.

2.Комплемент сыворотки крови.

3.Физиологический раствор.

4.Взвесь отмытых эритроцитов барана в разведении 1:40 на физиологическом растворе.

5.Стеклянная посуда

6.Дозаторы объѐмом 0,1-1 и 0,01-0,1мл.

7.Водяная баня

8.Штативы для пробирок.

4.2 ГЛАВНЫЙ ОПЫТ РСК

Цель: исследование сыворотки больного животного, которое осуществляется в два этапа:

1.Готовят в первом ряду пробирок последовательные двух кратные разведения исследуемой сыворотки от 1:20 до 1:320. В втором ряду пробирок смешивают по 0.5 мл

разведений исследуемой сыворотки крови с антигеном и комплементом. Инкубируют при 37◦С 20 минут (табл. 4).

2.К исследуемой смеси добавляют гемолизин и эритроциты барана и вновь инкубируют при 37◦С 15 минут (табл. 4).

Параллельно ставят отрицательный и положительный контроли антигена, а также отрицательный контроль исследуемой сыворотки.

Предварительный учѐт реакции проводят сразу после инкубации, а окончательный через 18 часов после выдерживания при комнатной температуре.

Сначала учитывают контрольные пробирки.

Учѐт в ряду начинают с первой пробирки. Результат реакции оценивается в четырѐх крестовой системе:

«++++» - отсутствие гемолиза: через 15 минут жидкость красная сильно мутная; через 18 часов жидкость бесцветная прозрачная, на дне пробирки осадок эритроцитов;

«-» - полный гемолиз: через 15 минут жидкость красная прозрачная; через 18 часов жидкость красная прозрачная, на дне пробирки осадка эритроцитов нет;

Результат реакции на «++++» и «+++» считают положительным. Максимальное разведение исследуемой сыворотки крови с положительным результатом называют титром сыворотки в РСК.

10