Материал: Иммунология методические указания по выполнению лабораторных работ для студентов специальности 36.05.01 Ветеринария

ТЕМА 8. МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА)

Цель: техника постановки МФА

В МФА используют антитела, меченные флуоресцирующим красителем, который светится зелѐным светом под ультрафиолетовыми лучами. Метод используется для идентификации микробных клеток в мазках-отпечатках с патологического материала, в мазках из экссудата или микробной культуры.

На предметном стекле делают мазок из культуры микроорганизмов или мазокотпечаток с патологического материал. Подсушивают мазок на воздухе и фиксируют 15 минут в 96%-м этиловом спирте. На фиксированный подсушенный мазок наносят флуоресцирующие антитела на 20 минут при 37◦С в тѐмной влажной камере. Промывают препарат водой, подсушивают и просматривают масляной иммерсионной системой люминесцентного микроскопа.

Учѐт реакции. Результат реакции оценивается в четырѐх крестовой системе: «++++» - яркое свечение по периферии микробной клетки; «-» - отсутствие свечения микробных клеток.

Результат реакции на «++++» и «+++» считают положительными. Параллельно ставят "+" и "-" контроли.

Принцип метода. Выпадение в осадок комплекса антиген-антитело.

Ход анализа.

1.Каждому студенту провести МФА с одной культурой микроорганизмов.

2.Результаты МФА зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1.Диагностическая флуоресцирующая сыворотка.

2.Взвеси культур микроорганизмов.

3.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

4.Люминисцентный микроскоп с масляной иммерсией.

5.Бактериологические петли.

6.Газовые горелки.

7.Влажная камера.

8.Оборудование для окрашивания мазков.

9.Штатив для пробирок.

10.Спирт.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / В. Н. Кисленко. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

16

ТЕМА 9. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

Цель: техника постановки ИФА для обнаружения антител в сыворотки крови животного

Для обнаружения антител в сыворотке крови больного животного используют меченные ферментом антивидовые антитела. Антивидовые антитела, меченные ферментом, присоединяются к комплексу антитело + антиген, затем комплекс выявляется субстратом.

Вряд лунок пластиковой микроплашки вносят по 0.2 мл антигена, инкубируют 15 минут при 37◦С. Антиген адсорбируется на поверхности лунок. Затем лунки промывают фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ), чтобы удалить избыток несорбированного на них антигена.

Не занятые антигеном участки поверхности лунки обрабатывают внесением в неѐ 0.3 мл 2%-го раствора сухого молока на 15 минут при 37◦С.

Вряд обработанных антигеном лунок вносят по 0.2 мл последовательных двух

кратных разведений исследуемой сыворотки в титрах с 1:100 до 1:204800, инкубируют 15 минут при 37◦С, затем промывают ФСБР, чтобы удалить несорбированные антитела.

Влунки вносят по 0.2 мл меченной ферментом антивидовой сыворотки, инкубируют 15 минут при 37◦С, затем отмывают ФСБР от не связавшихся антител.

Влунки вносят 0.2 мл раствора субстрата, инкубируют в темноте 15 минут при 20◦С, учитывают результат реакции по появлению окраски содержимого лунок.

Принцип метода. К комплексу антиген-антитело присоединяются меченные ферментом антивидовые антитела, которые выявляются по цветной реакции с субстратом.

Ход анализа.

1. Каждому студенту провести ИФА с одной сывороткой крови исследуемого животного.

2.Результаты ИФА зафиксировать в тетради.

Оборудование и биологические объекты

1.Исследуемые сыворотки животного.

2.Взвесь убитой культуры бактерий.

3.Меченная ферментом антивидовая сыворотка.

4.Раствор субстрата.

5.Дозаторы объѐмом 0,1-1 мл.

6.Пластиковые микроплашки

7.Шейкер с термостатом на 37◦С.

8.2%-й раствор сухого молока.

9.ФСБ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кисленко, В. Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии [Текст]: Учеб. пособие / В. Н. Кисленко. – М.: КолосС, 2005. – 232 с.

17

Тема 5. Использование розбенгал пробы (РБП) и кольцевой реакции с молоком

18