Статья: Исследование молекулярно-генетических маркеров риска развития вибрационной болезни у шахтеров-угольщиков Кузбасса

Научно-исследовательский институт комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний

УДК 575:613.644

Исследование молекулярно-генетических маркеров риска развития вибрационной болезни у шахтеров-угольщиков Кузбасса

Ядыкина Т.К., Захаренков В.В., Гафаров Н.И.,

Казицкая А.С., Гуляева О.Н., Панев Н.И.,

Жукова А.Г., Лузина Ф.А., Зинина М.В., Семенова Е.А.

Новокузнецк

Введение

Наследственная предрасположенность определяется комбинацией аллелей ряда генов, сочетание которых с внешними средовыми факторами может приводить к развитию заболевания. В структуре профессиональной заболеваемости Кузбасса - региона с развитой угледобывающей и металлургической промышленностью - большая доля патологий у шахтёров-угольщиков приходится на профессиональные заболевания опорно-двигательного аппарата, нейросенсорную тугоухость, болезни органов дыхания. Развитию этих патологий способствуют неблагоприятные факторы при добыче полезных ископаемых, в частности воздействие вибрации, шума, пыли различного химического состава, а также физическое перенапряжение и статические нагрузки в условиях охлаждающего микроклимата. Сочетанное действие факторов при стаже работы от 10-15 лет в данных условиях производственной среды приводит к развитию нейроортопедической патологии и болезней органов дыхания [1, 4, 7]. Следует отметить, что вибрационная болезнь (ВБ) очень редко встречается изолированно среди всех представленных нозологий у шахтёров-угольщиков и носит специфический характер. Это касается в первую очередь работников, занимающихся не только подземной добычей угля в шахтах, но и на разрезах.

В основе формирования ВБ лежит сложный механизм нервно-рефлекторных и нейрогуморальных нарушений, приводящих к появлению очагов застойного возбуждения в различных отделах центральной нервной системы и симпатических ганглиях, изменениям периферического кровообращения и иннервации, развитию гипоксии и дистрофических поражений внутренних органов [1, 7]. ВБ характеризуется полиморфностью клинической симптоматики и своеобразием течения. Снижается вибрационная чувствительность, кожная температура кистей (ниже 25 °С), часто развивается цианоз, а также дистрофические нарушения в мышцах и астено-невротические реакции в виде головной боли, общей слабости, повышенной утомляемости, раздражительности. При этом клиника и характер течения ВБ определяются основными физическими параметрами вибрации, суммарным временем её воздействия, местом и площадью соприкосновения с вибрирующим источником, положением тела, а также сопутствующими гигиеническими факторами - шумом, физическим напряжением, микроклиматом и другими.

Исследования, посвящённые ассоциации полиморфных вариантов генов, связанных с риском развития ВБ, единичны [4, 5]. Однако известно, что у лиц, работающих на одном и том же предприятии в однотипных условиях труда, ВБ может существенно различаться по срокам развития, степени тяжести и характеру своего течения [7]. Вероятно, это зависит от биологических особенностей организма, определяющих неодинаковую чувствительность людей к действию производственной вибрации. Такое предположение подкрепляется известным фактом, что различия в течении ВБ могут быть обусловлены особенностями анатомической конституции человека.

Наряду с таким способом снижения профессиональной заболеваемости, как исключение неблагоприятного производственного фактора, провоцирующего развитие болезни, важное место занимают разработка методов ранней диагностики начальных стадий профессиональных заболеваний и своевременная профилактика, основанная на изучении наследственной предрасположенности к профессиональным заболеваниям. Это направление является приоритетным в современной медицине труда [7].

Изучение генетических маркеров, наиболее часто встречающихся у больных лиц, дает возможность судить об участии наследственных факторов в развитии того или иного заболевания и выявлять среди населения группы лиц с генотипами повышенного риска и определять меры своевременной профилактики. Гены ферментов биотрансформации чрезвычайно полиморфны и полифункциональны, их роль не ограничивается защитной функцией в активном метаболизме экзогенных и эндогенных веществ прежде всего токсичного генеза. Разные аллели этих генов могут кодировать белки, различающиеся по уровню ферментативной активности, что обуславливает индивидуальную метаболическую специфичность и может выступать в качестве основы индивидуальной предрасположенности к некоторым нозологиям [10, 11].

Изучение полиморфных вариантов генов ферментов, задействованных в первой фазе биотрансформации ксенобиотиков - CYP1A1, а также генов второй фазы - семейства глутатион-S-трансфераз (GST), выявление генетических маркёров (сывороточных белков и эритроцитарных изоферментов) повышенной чувствительности к изменяющимся внешнесредовым условиям будут способствовать дальнейшему развитию модели формирования адаптации и генетической предрасположенности к профессиональным заболеваниям органов дыхания в сочетании с вибрационной патологией при воздействии вредных факторов производственной среды.

В связи с вышесказанным, исследование индивидуальных генетических систем у больных ВБ является чрезвычайно актуальным.

Цель настоящей работы - изучить связь биохимического и молекулярно-генетического полиморфизма с предрасположенностью к ВБ - профессиональному заболеванию работников угледобывающих шахт Кузбасса.

Материал и методы

Исследование проходило на базе клиники НИИ КПГПЗ. Основную группу больных составили шахтёры, работающие в контакте с вибрацией, имеющие диагностированную вибрационную патологию различной степени выраженности. Контрольную группу составили работники шахт, не страдающие ВБ. Возраст обследованных - от 30 до 60 лет (преобладающий возраст представленной выборки составил 40-50 лет), пол мужской.

Материалом для исследования служили образцы венозной крови. Белки и изоферменты разделяли методом электрофореза в полиакриламидном (ПААГ) и крахмальном геле [3, 6]. Ингибитор протеаз б-I-антитрипсин разделяли методом изоэлектрофокусирования в ПААГ [8]. По этой системе регистрировали 6 генотипов ММ, а также редкие генотипы MS и M и Z, объединенные в один класс MR. Разделение изоферментов кислой фосфатазы АсР эритроцитов проводилось в крахмальном геле, в трис-цитратной системе, рН - 6,8 [9].

Ген GSTT1 кодирует глутатион-S-трансферазу класса и, которая локализована в эритроцитах и связана со II-й фазой биотрансформации. «Нуль-аллель», или делеция, в этом гене в гомозиготном состоянии обуславливает нулевую активность его продукта. Частота «нуль-аллеля» у европеоидов достигает 38%.

Полиморфизм GSTT1 может приводить к индивидуальным различиям в восприимчивости к различным факторам среды. Ген GSTM1 кодирует фермент глутатион-S-трансферазу класса м, который, в частности, метаболизирует ксенобиотики совместно с цитохромами Р450. «Нулевой» аллель GSTM1 (-) обусловлен делецией гена GSTM1, его частота в некоторых популяциях достигает 45-50%. Отсутствие активности продукта GSTM1 может быть фактором риска развития сочетанных патологий различных органов и систем [11].

Выделение ДНК проводилось стандартным фенол-хлороформным методом. Для проведения молекулярно-генетических исследований образцы ДНК растворяли в 100 мкл Н₂О и хранили при t -20 °С. Типирование генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1 проводили методом полимеразной цепной реакции (RealTime) на приборе ДТпрайм 4 ООО «НПО ДНК-Технология».

Тест-системы для молекулярно-генетического анализа полиморфных локусов rs 4646903 гена CYP1A1, а также полиморфизмов генов GSTT1 и GSTM1 были разработаны в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук и синтезированы ООО «СибДНК».

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью классических алгоритмов биометрии.

Достоверность различий в распределении ассоциаций полиморфных вариантов между больными лицами и контролем оценивали по критерию ² с поправкой Йетса на непрерывность и величину относительных шансов OR (oddis ratio) при уровне значимости р?0,05, которая показывает, во сколько раз чаще болезнь развивается у лиц с наличием данного генотипа по сравнению с теми, у кого он отсутствует [3]: OR?1 рассматривали как отрицательную ассоциацию аллеля с заболеванием, а OR?1 - как положительную ассоциацию при ²?3,841.

Результаты

Распределение частот генотипов HP, GC, EsD, AcP, PI в группе шахтеров-угольщиков, страдающих ВБ, и в группе здоровых лиц по большинству изученных маркеров (НР, GC, EsD) соответствовало наблюдаемому и ожидаемому распределению генотипов исходя из равновесия Харди-Вайнберга, за исключением локусов АСР и PI, по которым показано статистически значимое отклонение в обеих изученных группах.

В то же время по всем изученным маркерам в обследованных выборках частоты аллелей и генотипов находились в границах значений, показанных для европеоидного русского населения РФ и Сибири [2, 3, 8].

К генотипам риска относится НР 1-1. С возрастом (от 40 лет до 60 лет и старше) частота этого генотипа снижается с 17,6% до 11,1%. С увеличением возраста и стажа работы частота развития ВБ возрастает [4, 5].

Таким образом, в данной ситуации наблюдается сопряжённый процесс. С одной стороны, с возрастом возрастает число больных ВБ, и при этом наиболее подвержены ВБ обладатели генотипов НР 1-1. С другой стороны, по мере увеличения возраста (и, соответственно, стажа работы) убывает число обладателей таких генотипов именно в силу их большей подверженности ВБ и более быстрому выбыванию с производства.

Изучение генетических прогностических факторов в комплексе с клиническими исследованиями позволит разработать на их основе новые прогностические модели, что является чрезвычайно актуальным направлением современной медицины труда и профпатологии.

В результате метаболизма токсикантов, а также сочетанного воздействия на организм факторов среды, особенно негативных (в том числе курения, повышенных/пониженных температур, запылённости, шума, вибрации и многих других), зачастую развивается окислительный стресс. Нарушение антиоксидантной защиты приводит к дестабилизации биологических мембран, активации процессов липопероксидации, расстройствам оксигенации, трофики тканей и стойким нарушениям гемостаза. шахта вибрационный биохимический симптоматика

Гаптоглобин - специфический острофазовый транспротеин, участвующий в связывании с гемоглобином. Основной физиологической функцией гаптоглобина является сохранение железа в организме, кроме того, комплекс гемоглобин-гаптоглобин обладает высокой пероксидазной активностью, оказывая тормозящий эффект на процессы перекисного окисления липидов.

Концентрация белка гаптоглобина (НР) в выборке обследованных лиц колебалась от 90 до 360 мг%, но в основном её значения составляли 150-200 мг%, т.е. в пределах нормы. Соотношение концентраций гаптоглобина по генотипам НР1-1/НР1-2/НР 2-2 в изученной нами выборке (табл. 1) составляет 183:185:161 мг%.

Таблица 1

Распределение генотипов гаптоглобина (НР) и его концентрация (мг%) у здоровых и больных лиц

Полученные результаты чрезвычайно важны для прогнозирования риска развития ВБ и для коррекции соответствующих этапов лечения. В таблице 2 представлены данные по концентрации НР и Hb в 3-х возрастных группах больных лиц.

Таблица 2

Концентрация белка гаптоглобина (НР) и гемоглобина (Hb) у больных ВБ разного возраста

По мере уменьшения количества Hb в крови возрастает количество НР, который связывает свободный Hb, таким образом частично компенсируя потерю организмом железа. Это тем более важно, так как с возрастом интенсивность гемопоэза снижается, уменьшается количество как связанного, так и свободного Hb. Такой компенсаторный механизм может играть определённую роль при ВБ, когда нарушается микроциркуляция и ухудшается трофика и газообмен в тканях конечностей и соединительной ткани. Это не единственное объяснение этого феномена. Нельзя исключать возрастание концентрации НР как белка «острой фазы» при воспалительных процессах, которые, как правило, сопровождают ВБ. Наконец, это может быть и чисто возрастным процессом, не связанным с ВБ. Для выяснения этого необходимы исследования на больших выборках здоровых людей.