ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(СЕЧЕНОВСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ)
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ НИКЛОЗАМИДА И КОМБИНИРОВАННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
03.01.04 - Биохимия
Автореферат
Жирник Александр Сергеевич
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Москалёва Елизавета Юрьевна
Москва 2018
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Рост заболеваемости и смертности от онкологических заболеваний обуславливает необходимость поиска способов повышения эффективности химиотерапии и лучевой терапии злокачественных новообразований. Полагают, что использование препаратов, действующих не просто на опухолевые клетки, а на клетки с фенотипом множественной лекарственной устойчивости, позволит предотвратить прогрессирование заболевания (Islam et al., 2015). Для пролонгирования действия и снижения неспецифической токсичности гидрофобных противоопухолевых препаратов разрабатываются технологии включения их в полимерные частицы субмикронных размеров (Nie et al., 2007). Актуальной проблемой при этом остаётся изучение механизма действия препаратов в полимерной форме, включая изучение возможности интернализации полученных частиц в опухолевые клетки. Перспективным способом повышения эффективности лучевой терапии представляется использование новых малотоксичных радиосенсибилизаторов, повышающих чувствительность опухолевых клеток к действию излучения (Ding et al., 2013; Kumar et al., 2016). Результаты исследований последних лет указывают на то, что лекарственный препарат никлозамид, использующийся в медицине как антигельминтное средство более 50 лет, обладает высокой противоопухолевой активностью в отношении различных видов злокачественных новообразований (Li et al., 2014). Установлено, что в основе цитотоксического действия никлозамида на опухолевые клетки может лежать нарушение функциональной активности митохондрий и ингибирование ряда сигнальных путей, однако, механизмы действия препарата на опухолевые клетки изучены недостаточно. Более того, имеются лишь ограниченные данные о радиосенсибилизирующей активности никлозамида в отношении опухолевых клеток (You et al., 2014; Yin et al., 2016) и возможности его использования для усиления действия применяемых в клинике противоопухолевых препаратов (Chen et al., 2017).
В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение противоопухолевой активности никлозамида в свободной и полимерной форме и изучение радиосенсибилизирующего действия никлозамида на культурах клеток человека и мыши.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: никлозамид клетка колоректальный рак
1. изучение цитотоксической активности никлозамида в отношении опухолевых и нормальных клеток человека
2. характеристика фенотипа клеток колоректального рака (КРР) человека и изучение действия никлозамида на опухолевые клетки человека с фенотипом множественной лекарственной устойчивости
3. изучение цитотоксической активности полимерной формы никлозамида (ПФН) в отношении опухолевых и нормальных клеток человека
4. изучение цитотоксической активности цисплатина в комбинации с никлозамидом и ПФН в отношении клеток меланомы мыши
5. изучение закономерностей накопления биосовместимых биодеградируемых полимерных частиц клетками КРР человека
6. изучение молекулярных механизмов действия никлозамида в свободной и полимерной форме в отношении клеток КРР человека
7. изучение механизмов радиосенсибилизирующего действия никлозамида в отношении клеток КРР человека
Научная новизна работы. Впервые показано, что клетки меланомы и КРР человека с фенотипом множественной лекарственной устойчивости, обусловленным высоким уровнем экспрессии белка MDR1, чувствительны к действию никлозамида. Впервые показана более высокая по сравнению с никлозамидом цитотоксическая активность ПФН в отношении клеток КРР человека. Впервые показано аддитивное действие цисплатина и никлозамида в свободной и полимерной форме в отношении клеток меланомы мыши. Показана интернализация полимерных частиц опухолевыми клетками. Впервые установлено, что молекулярный механизм противоопухолевого действия никлозамида в свободной и полимерной форме в отношении клеток КРР человека одинаков и связан с развитием окислительного стресса, вызванного повреждением митохондрий. Впервые обнаружено, что никлозамид проявляет радиосенсибилизирующее действие в отношении клеток КРР человека, в основе которого лежит ингибирование репарации двунитевых разрывов ДНК.
Практическая значимость исследования. Важное практическое значение имеют новые данные о противоопухолевой активности никлозамида в отношении широкого спектра опухолевых линий клеток. Показана высокая цитотоксическая активность никлозамида в свободной и полимерной форме в отношении опухолевых клеток и низкая токсичность в отношении нормальных клеток. Показана активность никлозамида в качестве радиосенсибилизатора. Полученные результаты являются основой для проведения доклинических и клинических исследований противоопухолевой и радиосенсибилизирующей активности никлозамида в свободной и полимерной форме.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на XIII, XIV и XV Курчатовской междисциплинарной молодёжной научной школе (Москва, 2015, 2016, 2017), VI Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2015), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов - 2016» (Москва, 2016), Международном научно-практическом форуме «Ядерные технологии на страже здоровья» (Москва, 2016).
Публикации. Основное содержание диссертации представлено в 10 публикациях, в том числе в 3 статьях в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по изучаемой теме и выполнена основная часть экспериментов, осуществлены статистическая обработка полученных данных и обсуждение результатов исследования, сформулированы выводы и оформлена диссертационная работа. Автор благодарит коллег за предоставление полимерной формы никлозамида и флуоресцентно меченых полимерных наночастиц.
Основные положения работы:
1. никлозамид обладает цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток человека, значительно меньшей в отношении нормальных клеток
2. никлозамид эффективно действует на опухолевые клетки человека, экспрессирующие белки MDR-1 и Bcl-2, определяющие множественную лекарственную устойчивость
3. использование никлозамида в полимерной форме позволяет повысить его активность в отношении опухолевых клеток без изменения токсичности в отношении нормальных клеток
4. комбинированное использование никлозамида в свободной и полимерной форме и цисплатина повышает эффективность действия препаратов в отношении клеток меланомы мыши
5. уровень накопления биосовместимых биодеградируемых полимерных частиц в клетках КРР человека зависит от концентрации частиц и продолжительности инкубации и достигает максимальных значений через 1-4 часа в зависимости от типа клеток
6. механизм цитотоксического действия ПФН и никлозамида в отношении клеток КРР человека одинаков и связан с развитием окислительного стресса, вызванного повреждением митохондрий
7. никлозамид обладает радиосенсибилизирующей активностью в отношении клеток КРР человека, в основе которой лежит ингибирование репарации двунитевых разрывов ДНК
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Культивирование клеток различных перевиваемых линий. Клетки меланомы человека линий Mel-8, Mel-10, MS, аденокарциномы ободочной кишки линии Caco-2, карциномы сигмовидной кишки линии COLO 320 HSR, аденокарциномы прямой кишки линии SW837, мелкоклеточного рака лёгкого линии H69, клетки меланомы мыши линии B16, а также нормальные клетки - клетки почки эмбриона человека линии HEK293 и лёгочные эмбриональные фибробласты человека линии ЛЭЧ - культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота (СПК) и 50 мкг/мл гентамицина в пластиковых культуральных флаконах в CO2-инкубаторе при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2.
Анализ выживаемости клеток методом МТТ-теста. Выживаемость опухолевых и нормальных клеток после инкубации с никлозамидом и ПФН в течение 72 ч оценивали с помощью МТТ-теста по методу Mosmann с использованием раствора МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) в концентрации 1 мг/мл в среде для культивирования клеток. После развития окраски (через 2-4 часа инкубации) среду удаляли, кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО и измеряли интенсивность окраски по поглощению при 540 нм с помощью многоканального спектрофотометра iMark (Bio-Rad). Выживаемость клеток оценивали в процентах от их количества в контрольных пробах. Оптическая плотность полученного раствора при оценке колориметрическим методом пропорциональна количеству живых клеток. По полученным данным строили графики зависимости выживаемости клеток от концентрации препаратов и по ним рассчитывали значения IC50 для характеристики чувствительности клеток к свободному препарату и к ПФН.
Анализ содержания белка MDR1 на мембране клеток. Клетки линий SW837 и COLO 320 HSR трижды промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), суспендировали в ФСБ, содержащем 3% СПК, в концентрации 1Ч106/мл и инкубировали с антителами мыши, конъюгированными с фикоэритрином, в течение 60 мин при 4°С в темноте. Затем клетки отмывали ФСБ, содержащем 3% СПК. Долю окрашенных клеток и интенсивность флуоресценции фикоэритрина анализировали при длине волны возбуждения 488 нм и полосе пропускания 620 нм на проточном цитофлуориметре BD FACSCalibur (BD Biosciences). Для измерения использовали не менее 20 тыс. клеток на пробу. Изотипические антитела мыши, конъюгированные с фикоэритрином, использовали для получения отрицательного контроля.
Анализ содержания белка Bcl-2. Клетки линий SW837 и COLO 320 HSR промывали ФСБ, фиксировали в 2% растворе параформальдегида в течение 20 мин при комнатной температуре. Образцы хранили в ФСБ, содержащем 0,02% NaN3, при 4°C до проведения измерений. Перед исследованием клетки пермеабилизировали с помощью ФСБ, содержащего 0,25% тритон X-100 и 2% БСА, в течение 30 мин при комнатной температуре, отмывали в ФСБ, содержащем 0,1% тритон X-100 и 10% СПК, инкубировали с первичными антителами мыши в течение 60 мин при комнатной температуре, отмывали и инкубировали со вторичными антителами козы к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с Alexa Fluor 488, в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем отмывали в ФСБ, содержащем 0,1% тритон X-100 и 10% СПК, и анализировали с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) не менее 20 тыс. клеток на пробу. Вторичные антитела козы использовали для получения отрицательного контроля.
Получение и характеристика ПФН. Получение и характеристику препарата ПФН проводил коллектив химиков лаборатории клеточной биологии и молекулярной медицины НИЦ «Курчатовский институт» под руководством Е.А. Воронцова. Получение ПФН на основе сополимера молочной и гликолевой кислот с добавлением вспомогательных компонентов осуществляли методом эмульгирования в системе «масло/вода». Содержание никлозамида в ПФН, определённое методом ВЭЖХ, составило 5,2±0,4%. Средний размер полимерных частиц, определённый методом динамического светорассеяния с использованием анализатора частиц Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 (Malvern Instruments), составил 240,9±3,1 нм.
Анализ выживаемости опухолевых клеток при действии цисплатина в комбинации с никлозамидом и ПФН. Выживаемость клеток меланомы мыши линии B16 после инкубации с цисплатином (0,5 мг/мл раствор для инфузий «Цисплатин-ЛЭНС®»), никлозамидом, ПФН и комбинациями препаратов в течение 72 ч оценивали с помощью МТТ-теста как описано ранее. Предварительно готовили общие растворы препаратов в концентрациях, кратных соответствующим значениям IC50 и взятых в соотношении 2:1 для цисплатина и никлозамида или цисплатина и ПФН соответственно. Показатель аддитивности (combination index) рассчитывали по методу Chou and Talalay с помощью программы «CompuSyn» («ComboSyn») и по его величине судили о характере взаимодействия препаратов при их комбинированном применении (CI < 1, синергизм; CI = 1, аддитивное действие; CI > 1, антагонизм).