5. Исследование закономерностей накопления флуоресцентно меченых полимерных частиц клетками КРР человека
Более высокая активность ПФН в сравнении с никлозамидом может быть связана с эффективным проникновением частиц через клеточную мембрану и созданием более высокой внутриклеточной концентрации никлозамида, благодаря его высвобождению в цитоплазме клеток. Поэтому далее были изучены закономерности накопления наночастиц на основе блок-сополимера поли(лактид-ко-гликолида) и полиэтиленгликоля в клетках КРР человека линий COLO 320 HSR и SW837. С помощью проточной цитофлуориметрии показано, что в течение 24 часов общее накопление ФПН пропорционально концентрации ФПН в среде и времени инкубации с опухолевыми клетками человека обеих исследованных линий (рис. 4). В то же время, доля частиц внутри клеток, в отличие от их общего накопления, достигает максимума уже через 1 час (линия COLO 320 HSR) и через 4 часа (линия SW837) и остаётся постоянной при дальнейшей инкубации (рис. 5), что приводит к снижению эффективности транслокации ФПН во внутриклеточные компартменты (рис. 6) и указывает на насыщаемость процесса интернализации данных частиц опухолевыми клетками.
Рис. 4 Общее накопление ФПН опухолевыми клетками человека линий COLO 320 HSR (А) и SW837 (Б) в зависимости от их концентрации через 1 ч (1), 4 ч (2) и 24 ч (3)
Рис. 5 Сравнение динамики общего накопления (1) флуоресцентно меченых полимерных наночастиц PLGA-PEG-FITC и их содержания внутри (2) опухолевых клеток человека линий COLO 320 HSR (А) и SW837 (Б) при концентрации частиц 2.5 мкМ по ФИТЦ
Рис. 6 Эффективность внутриклеточного накопления ФНП в опухолевых клетках линий COLO 320 HSR (А) и SW837 (Б) в зависимости от времени инкубации; концентрация ФПН составила 2,5 мкМ (1) и 5 мкМ (2) по ФИТЦ
6. Исследование молекулярного механизма действия никлозамида и ПФН в отношении клеток КРР человека различных линий
Показано, что действие никлозамида на клетки КРР человека линий Caco-2, SW837 и COLO 320 HSR приводит к повреждению митохондрий, регистрируемому по снижению накопления родамина-123 (рис. 7). Это сопровождается повышением уровня образования и общего количества активных форм кислорода, в особенности митохондриального супероксид-аниона (рис. 8). При инкубации клеток всех исследованных линий КРР с никлозамидом в относительно невысокой концентрации, равной 1 мкМ, было обнаружено увеличение доли клеток, находящихся в G0/G1-фазе (рис. 9). Важно отметить, что все обнаруженные изменения были более интенсивными при использовании ПФН.
Рис. 7 Динамика изменения уровня накопления флуоресцентного красителя родамина-123 в клетках аденокарциномы прямой кишки линии SW837 (1), аденокарциномы ободочной кишки линии Caco-2 (2) и карциномы сигмовидной кишки линии COLO 320 HSR (3) после инкубации клеток с никлозамидом (А) и с ПФН (Б) в концентрации 1 мкМ. * - отличия от контроля достоверны, p<0,05
Рис. 8 Изменение общего уровня активных форм кислорода, оцениваемого по накоплению флуоресцентного красителя carboxy-H2DCFDA (А-Г), и уровня митохондриального супероксид-аниона, оцениваемого по накоплению флуоресцентного красителя MitoSOX Red (Д-З), в клетках линии COLO 320 HSR после инкубации в течение 1 ч с никлозамидом, ПФН и «пустыми частицами». А, Д - контрольные клетки; Б, Е - клетки после инкубации с никлозамидом (1 мкМ); В, Ж - после инкубации с ПФН (1 мкМ); Г, З - после инкубации с «пустыми частицами». М1 - вся популяция клеток, М2 - фракция клеток, интенсивно накапливающих красители, указана доля этих клеток в процентах и их средняя интенсивность флуоресценции - MFI, усл. ед. Данные одного из трёх типичных экспериментов
Рис. 9 Гистограммы распределения клеток аденокарциномы прямой кишки линии SW837, аденокарциномы ободочной кишки линии Caco-2 и карциномы сигмовидной кишки человека линии COLO 320 HSR по фазам клеточного цикла через 24 ч культивирования в присутствии никлозамида и ПФН в концентрации 1 мкМ
7. Исследование радиосенсибилизирующего действия никлозамида в отношении клеток КРР
Обнаружено, что никлозамид вызывает гибель клеток КРР человека линий SW837 и COLO 320 HSR и усиливает действие г-излучения, о чём свидетельствует более глубокое снижение выживаемости опухолевых клеток при совместном действии г-излучения и никлозамида в сравнении с действием каждого из этих воздействий в отдельности (рис. 10).
Рис. 10 Влияние никлозамида (2 мкМ), г-излучения (2 Гр) и их комбинации на выживаемость клеток линий SW837 (А) и COLO 320 HSR (Б) через 7 суток после облучения. Данные представлены в процентах от контроля. * - отличия от контроля достоверны, р<0,05; & - отличия от действия никлозамида достоверны, р<0,05; # - отличия от действия г-излучения достоверны, р<0,05
По данным литературы, ингибирование сигнального пути Wnt/в-катенин является возможным механизмом радиосенсибилизирующего действия никлозамида в отношении клеток трижды негативного рака молочной железы. При комбинированном применении г-излучения и никлозамида в клетках линии COLO 320 HSR наблюдали более глубокое снижение уровня в-катенина в сравнении с действием г-излучения и никлозамида по отдельности; напротив, содержание в-катенина в клетках линии SW837 оставалось неизменным при действии никлозамида, облучения и их комбинации (рис. 11).
Рис. 11 Уровень в-катенина в клетках линий SW837 (А,В) и COLO 320 HSR (Б,Г). 1 - аутофлуоресценция; 2 - флуоресценция контрольных клеток; 3 - флуоресценция клеток при совместном действии г-излучения (2 Гр) и никлозамида (2 мкМ). MFI - средняя интенсивность флуоресценции, усл. ед. * - отличия от контроля достоверны, р<0,05; & - отличия от действия никлозамида достоверны, р<0,05; # - отличия от действия г-излучения достоверны, р<0,05
Известно, что никлозамид разобщает клеточное дыхание и окислительное фосфорилирование и приводит к снижению уровня АТФ в различных типах опухолевых клеток. Нами показано, что снижение уровня АТФ в свою очередь может приводить к ингибированию репарации двунитевых разрывов ДНК (ДР ДНК), образующихся при действии г-излучения. При действии г-излучения в дозе 2 Гр происходило увеличение уровня гистона гH2AX в 2,0 и 1,8 раз относительно фонового уровня в клетках линий SW837 и COLO 320 HSR соответственно через 1 час после облучения. В тоже время, через 24 часа уровень гистона гH2AX в облучённых клетках снижался до исходного значения, а в клетках, предварительно обработанных никлозамидом в концентрации 2 мкМ, уровень гH2AX оставался в 1,6 раза выше, чем в контрольных клетках (рис. 12).
Рис. 12 Уровень гистона гН2АХ в клетках линий SW837 (А) и COLO 320 HSR (Б) после действия никлозамида (2 мкМ), г-излучения (2 Гр) и их комбинации через 1 и 24 часа после облучения. Значение MFI в контроле составило 8,2 и 5,0 усл. ед. для клеток линий SW837 и COLO 320 HSR соответственно. Данные представлены в процентах от контроля. * - отличия от контроля достоверны, р<0,05; & - отличия от действия никлозамида достоверны, р<0,05; # - отличия от действия г-излучения через 1 час достоверны, р<0,05
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что никлозамид проявляет радиосенсибилизирующую активность в отношении клеток КРР человека, в основе которой может лежать не только ингибирование сигнального пути Wnt/в-катенин, но и иные механизмы, и в первую очередь обнаруженное ингибирование репарации ДР ДНК.
Выводы
1. Показана высокая цитотоксическая активность никлозамида в отношении опухолевых клеток и менее высокая в отношении нормальных клеток
2. Показано эффективное действие никлозамида на опухолевые клетки, экспрессирующие белки MDR1 и Bcl-2
3. Обнаружено повышение активности никлозамида в отношении опухолевых клеток и снижение токсичности в отношении нормальных клеток при включении его в полимерные частицы субмикронного размера
4. Обнаружено усиление цитотоксического действия цисплатина в отношении клеток меланомы мыши при его комбинированном применении с никлозамидом в свободной и полимерной форме
5. Показана эффективная интернализация биосовместимых биодеградируемых полимерных частиц клетками КРР человека
6. Выявлен одинаковый молекулярный механизм противоопухолевого действия никлозамида в свободной и полимерной форме в отношении клеток КРР, который связан с повреждением митохондрий и развитием окислительного стресса
7. Обнаружено радиосенсибилизирующее действие никлозамида на клетки КРР, в основе которого лежит ингибирование репарации ДР ДНК
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Жирник А.С., Никольская Е.Д., Посыпанова Г.А., Сёмочкина Ю.П. Исследование эффективности проникновения полимерных наночастиц на основе PLGA в опухолевые клетки человека // Юбилейная XV Курчатовская междисциплинарная молодёжная научная школа. Москва, Россия, 2017. С. 80.
2. Жирник А.С., Сёмочкина Ю.П., Москалёва Е.Ю., Крылов Н.И., Тубашева И.А., Кузнецов С.Л., Воронцов Е.А. Молекулярные механизмы противоопухолевой активности полимерной формы никлозамида в отношении клеток колоректального рака // Биомедицинская химия. 2017. Т. 63. № 2. С. 132-138.
3. Противоопухолевое лекарственное средство на основе никлозамида [Текст]: пат. 2617049 Рос. Федерация: МПК A61P35/00, A61K31/167 / Воронцов Е.А., Гукасова Н.В., Жирник А.С., Кузнецов С.Л., Москалёва Е.Ю., Тубашева И.А., Посыпанова Г.А., Родина А.В.; заявитель и патентообладатель НИЦ «Курчатовский институт». № RU2016118486A; заявл. 12.05.2016; опубл. 19.04.2017, Бюл. № 1. 19 с.
4. Жирник А.С., Крылов Н.И., Сёмочкина Ю.П. Исследование молекулярных механизмов действия никлозамида в полимерной форме на клетки колоректального рака человека // XIV Курчатовская междисциплинарная молодёжная научная школа -Москва, Россия, 2016. С. 78.
5. Жирник А.С., Сёмочкина Ю.П., Крылов Н.И. Повышение чувствительности клеток колоректального рака к действию ионизирующего излучения под действием никлозамида и его полимерной формы // Международный научно-практический форум «Ядерные технологии на страже здоровья» - Москва, Россия, 2016. С. 63-65.
6. Жирник А.С., Крылов Н.И. Цитотоксическая активность полимерной формы никлозамида в отношении опухолевых клеток различных линий // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов - 2016». Москва, Россия, 2016. С. 58.
7. Жирник А.С., Сёмочкина Ю.П., Москалёва Е.Ю., Перевозчикова В.Г., Родина А.В., Северин С.Е. Антипролиферативная активность никлозамида в отношении клеток меланомы и колоректального рака // Химико-фармацевтический журнал. 2016. Т. 50. № 7. С. 40-43.
8. Жирник А.С., Сёмочкина Ю.П. Исследование активности никлозамида в отношении опухолевых стволовых клеток меланомы и колоректального рака // XIII Курчатовская молодёжная научная школа - Москва, Россия, 2015. С. 63.
9. Жирник А.С., Москалёва Е.Ю., Северин С.Е. Изучение противоопухолевой активности никлозамида в отношении клеток линий меланомы и колоректального рака // VI Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» - Ростов-на-Дону, Россия, 2015. С. 148-149.
10. Москалёва Е.Ю., Перевозчикова В.Г., Жирник А.С., Северин С.Е. Молекулярные механизмы противоопухолевой активности никлозамида // Биомедицинская химия. 2015. Т. 61. № 6. С. 680-693.