Автореферат: Исследование противоопухолевой активности никлозамида и комбинированных воздействий с его использованием

Получение и характеристика флуоресцентно меченых полимерных наночастиц. Получение и характеристику флуоресцентно меченных полимерных наночастиц (ФПН) проводил коллектив химиков лаборатории клеточной биологии и молекулярной медицины НИЦ «Курчатовский институт» под руководством Е.А. Воронцова. Получение ФПН на основе блок-сополимера поли(лактид-ко-гликолида) и полиэтиленгликоля с добавлением вспомогательных компонентов осуществляли стандартным методом нанопреципитации; в качестве флуоресцентной метки использовали флуоресцеин-5-изотиоцианат (ФИТЦ). Характеристика полученных ФПН приведена в таблице 1.

Таблица 1

Основные физико-химические характеристики ФПН.

Анализ накопления флуоресцентно меченых частиц опухолевыми клетками. По окончании инкубации с ФПН клетки снимали с подложки, центрифугировали, клеточный осадок отмывали дважды холодным ФСБ, ресуспендировали в изотоническом 0.013 М цитратном буфере (pH 4.0), инкубировали в течение 30 с на льду и измеряли интенсивность флуоресценции на проточном цитофлуориметре BD FACSCalibur (BD Biosciences) при длине волны возбуждения 488 нм и эмиссии 520 нм; анализировали по 10 тысяч клеток на пробу. Для количественного анализа внутриклеточной фракции ФПН к суспензии клеток в цитратном буфере добавляли трипановый синий в конечной концентрации 0.2 мг/мл, инкубировали в течение 30 с на льду и анализировали интенсивность флуоресценции на проточном цитофлуориметре в тех же условиях.

Исследование уровня повреждений митохондрий по снижению накопления родамина-123. После инкубации с никлозамидом и ПФН клетки центрифугировали и осадок ресуспендировали в тёплой бессывороточной среде в концентрации 1 млн/мл. К суспензии клеток добавляли родамин-123 (0,1 мкг/мл) и инкубировали в течение 30 мин при 37°C на водяной бане, периодически помешивая. Для контроля аутофлуоресценции 1 мл суспензии клеток оставляли в среде без родамина-123. Для исключения популяции мёртвых и погибающих клеток при цитофлуориметрии в пробу добавляли раствор йодистого пропидия (2 мкг/мл) непосредственно перед измерением. Флуоресценцию клеток измеряли с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) при двух длинах волн в красной и зелёной области спектра, при длине волны возбуждения 488 нм и полосе пропускания для зелёной области спектра - 525 нм (FL1), а для красной - 620 нм (FL3), анализировали по 50 тыс. клеток на пробу.

Определение уровня активных форм кислорода. В культуре клеток культуральную среду заменяли на ФСБ, содержащий реагент для определения уровня внутриклеточных активных форм кислорода carboxy-H2DCFDA (10 мкМ), и инкубировали 30 мин в стандартных условиях. Маточный раствор carboxy-H2DCFDA в концентрации 10 мкг/мл в стерильном ДМСО готовили непосредственно перед использованием. По окончании инкубации клетки дважды промывали ФСБ с 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и измеряли их флуоресценцию с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) при длине волны возбуждения 488 нм и полосе пропускания 525 нм (FL1), анализировали по 50 тыс. клеток на пробу.

Определение уровня митохондриального супероксидного аниона. Клетки дважды промывали ФСБ и инкубировали в свежеприготовленном рабочем растворе реагента для определения уровня митохондриального супероксидного аниона MitoSOX Red в ФСБ (5 мкМ) в течение 10 мин в стандартных условиях. Маточный раствор MitoSOX Red в концентрации 5 мМ готовили путём растворения содержимого одной ампулы (50 мкг) в 13 мкл стерильного ДМСО и хранили не более 1 месяца при -20°С. По окончании инкубации клетки дважды промывали ФСБ с 2% БСА и измеряли их флуоресценцию с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) при длине волны возбуждения 488 нм и полосе пропускания 585 нм (FL2), анализировали по 50 тыс. клеток на пробу.

Анализ клеточного цикла с использованием йодистого пропидия. Клетки собирали, промывали ФСБ, фиксировали 70% этанолом (1 млн клеток/мл этанола) при 4°С в течение 1-2 ч и хранили до исследования при -20°С. Фиксированные клетки осаждали центрифугированием при 400 g, промывали ФСБ перед использованием. Осадок ресуспендировали в растворе для окрашивания ДНК (ФСБ, рН 7,4, содержащий 0,1% Тритон Х-100, 0,1 мМ ЭДТА, 0,05 мг/мл рибонуклеазы А, 50 мкг/мл йодистого пропидия) в концентрации 1 млн клеток/мл раствора и инкубировали 1-1,5 ч при комнатной температуре. Исходный раствор рибонуклеазы А предварительно кипятили на водяной бане в течение 10 мин, чтобы избавиться от возможной примеси дезоксирибонуклеаз. Анализ проводили с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) при длине волны возбуждения 488 нм и эмиссии 620-700 нм. Долю клеток в состоянии апоптоза оценивали как фракцию гиподиплоидных клеток.

Облучение клеток. Клетки КРР человека линий SW837 и COLO 320 HSR облучали на установке «ГУТ-200М» (⁶⁰Co, 0,75 Гр/мин) при комнатной температуре в культуральной среде в дозе 2 Гр. Клетки облучали либо прикрепленными в культуральных планшетах (линия SW837), либо в суспензии в плотно закрытых пробирках (линия COLO 320 HSR). После облучения клетки помещали в СО₂-инкубатор и инкубировали необходимое время.

Анализ чувствительности опухолевых клеток к действию ионизирующего излучения в комбинации с никлозамидом. Клетки высевали в 12-луночные культуральные планшеты по 40 тыс. кл/лунку за сутки до исследования, инкубировали с никлозамидом в концентрации 2 мкМ в течение 24 ч и подвергали действию г-излучения в дозе 2 Гр при комнатной температуре. Через 1 час после облучения заменяли среду и продолжали культивирование клеток в течение 7 суток. Выживаемость определяли по количеству живых клеток в контрольных и опытных пробах с помощью камеры Горяева после окрашивания трипановым синим.

Анализ содержания в-катенина. Клетки высевали в 6 см чашки Петри в количестве 2Ч10⁶/чашку за сутки до исследования, инкубировали с никлозамидом в концентрации 2 мкМ в течение 4 часов и подвергали действию г-излучения в дозе 2 Гр. Через 24 часа после облучения эти клетки, а также контрольные клетки и клетки, обработанные никлозамидом в концентрации 2 мкМ, снимали с подложки, промывали ФСБ, фиксировали в 2% растворе параформальдегида в течение 20 мин при комнатной температуре. Образцы хранили в ФСБ, содержащем 0,02% NaN₃, при 4°C до проведения измерений. Перед исследованием клетки пермеабилизировали с помощью ФСБ, содержащего 0,25% тритон X-100 и 3% СПК, в течение 30 мин при комнатной температуре, отмывали и инкубировали с антителами мыши, конъюгированными с Alexa Fluor 488, в ФСБ, содержащем 3% СПК, в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем отмывали в ФСБ, содержащем 3% СПК, и анализировали с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences). Для измерения использовали не менее 20 тыс. клеток на пробу. Изотипические антитела мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 488, использовали для получения отрицательного контроля.

Анализ содержания гистона гН2АХ. Клетки за сутки до исследования высевали в 3,5 см чашки Петри в количестве 500 тыс. кл/чашку, инкубировали с никлозамидом в концентрации 2 мкМ в течение 4 часов и подвергали действию г-излучения в дозе 2 Гр. Через 1 и 24 часа после облучения эти клетки, а также контрольные клетки и клетки, обработанные никлозамидом в концентрации 2 мкМ, снимали с подложки, промывали ФСБ и фиксировали в абсолютном метаноле при +4°С в течение 20 мин. Образцы хранили в абсолютном метаноле при -20°C до проведения измерений. Перед исследованием клетки отмывали от метанола, инкубировали с антителами мыши, конъюгированными с Alexa Fluor 488, в ФСБ, содержащем 3% СПК, в течение 60 мин при комнатной температуре, отмывали в ФСБ, содержащем 3% СПК, и анализировали с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (BD Biosciences) не менее 20 тыс. клеток на пробу. Изотипические антитела мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 488, использовали для получения отрицательного контроля.

Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «OriginPro» («OriginLab») с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Стьюдента. Данные представляли в виде средних значений и стандартной ошибки среднего. Достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Исследование цитотоксической активности никлозамида в отношении опухолевых и нормальных клеток человека

Анализ чувствительности опухолевых и нормальных клеток к действию никлозамида проводили с помощью МТТ-теста. Согласно полученным результатам, никлозамид эффективен в отношении различных линий опухолевых клеток, но менее токсичен в отношении нормальных клеток (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика цитотоксической активности никлозамида в отношении опухолевых и нормальных клеток человека. Приведены средние значения IC₅₀ и стандартная ошибка среднего

* - отличия от линии ЛЭЧ достоверны, p<0,05; # - отличия от линии HEK293 достоверны, p<0,05

2. Характеристика фенотипа клеток КРР человека

Клетки КРР линий SW837 и COLO 320 HSR были охарактеризованы по уровню экспрессии ABC-транспортёра ABCB1 (MDR1) и Bcl-2. Обнаружен более высокий уровень экспрессии белка MDR1 в клетках карциномы сигмовидной кишки человека линии COLO 320 HSR, чем в клетках рака прямой кишки человека линии SW837 (рис. 1А,Б). В то же время, содержание белка Bcl-2 в клетках обеих линий было близким (рис. 1В,Г). Экспрессия белков MDR-1 и Bcl-2 в клетках исследованных линий может определять их устойчивость к повреждающим воздействиям.

Рис. 1 Экспрессия белков MDR1 (А,Б) и Bcl-2 (В,Г) в клетках КРР человека линий SW837 (A,В) и COLO 320 HSR (Б,Г). 1 - аутофлуоресценция, 2 - флуоресценция клеток, окрашенных соответствующими антителами. MFI - средняя интенсивность флуоресценции, усл. Ед

3. Исследование цитотоксической активности ПФН в отношении опухолевых и нормальных клеток человека

Анализ чувствительности опухолевых и нормальных клеток к действию ПФН проводили с помощью МТТ-теста. Показано, что ПФН обладает более высокой по сравнению с никлозамидом цитотоксической активностью в отношении клеток КРР человека и менее высокой в отношении лёгочных эмбриональных фибробластов человека (рис. 2). Необходимо отметить, что полимерные частицы, не содержащие никлозамид («пустые частицы»), практически не влияли на выживаемость клеток в диапазоне концентраций, соответствующих диапазону используемых концентраций ПФН: выживаемость клеток при концентрации «пустых частиц», равной даже 10 мкМ по никлозамиду, составляла не менее 85,2±8,4% от контроля.

Рис. 2 Влияние никлозамида (1) и ПФН (2) на выживаемость клеток аденокарциномы прямой кишки линии SW837 (А), аденокарциномы ободочной кишки линии Caco-2 (Б), карциномы сигмовидной кишки линии COLO 320 HSR (В) и лёгочных эмбриональных фибробластов человека (Г)

4. Исследование цитотоксической активности цисплатина в комбинации с никлозамидом в отношении клеток меланомы мыши

Обнаружено, что клетки меланомы мыши линии B16 чувствительны к действию цисплатина, никлозамида и ПФН: значение IC₅₀ составило 9,35±1,15 мкМ, 1,39±0,29 мкМ и 0,48±0,14 мкМ соответственно. Как показано на рис. 3А, при применении цисплатина в комбинации с никлозамидом наблюдается более глубокое снижение выживаемости опухолевых клеток в сравнении с цисплатином и никлозамидом по отдельности. Комбинированное применение цисплатина и ПФН также приводило к более интенсивной гибели клеток линии B16, чем при использовании каждого препарата по отдельности (рис. 3Б). Показатель аддитивности для комбинации цисплатина и никлозамида и комбинации цисплатина и ПФН составил 0,90 и 0,93 соответственно, что указывает на аддитивное действие препаратов при их комбинированном применении.

Рис. 3 Влияние никлозамида (А) и ПФН (Б) на эффективность действия цисплатина в отношении клеток меланомы мыши линии B16. 1 - цисплатин, 2 - никлозамид, 3 - комбинация цисплатина и никлозамида, 4 - ПФН, 5 - комбинация цисплатина и ПФН