На правах рукописи
Специальность 03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца
ОЗЕРОВА С.Г.
Москва - 2009
Работа выполнена в лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д.П. Филатова Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Научный руководитель: кандидат биологических наук Минин Андрей Александрович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Шарова Наталья Петровна
доктор биологических наук Катруха Алексей Генрихович
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН
Защита диссертации состоится 20 мая 2009 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26).
Автореферат разослан 20 апреля 2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова
1. Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Под активацией яйцеклетки в широком смысле понимают переход из состояния покоя к развитию. Активация происходит в процессе оплодотворения. Вопрос о том, какие клеточные и молекулярные механизмы задействованы в активации яйцеклетки, изучается на протяжении многих лет на самых разных живых объектах.
Для рыб характерно внешнее осеменение, при котором половые клетки выводятся в водную среду, где и происходит их слияние. Если осеменение не произошло, в неоплодотворенном яйце начинаются некоторые изменения, аналогичные происходящим при нормальном развитии, в частности повышение в цитоплазме концентрации свободных ионов кальция, экзоцитоз кортикальных гранул, образование оболочки оплодотворения. Для обозначения этого явления в литературе используются термины «спонтанная активация», «автоактивация». Природа включения спонтанной активации яйца рыб, равно как и активации при оплодотворении, остается неясной.
Изучение спонтанной активации имеет важное значение при решении некоторых проблем рыборазведения. Искусственное разведение рыб предполагает в качестве одной из задач разработку методов получения зрелых половых продуктов и проведение искусственного оплодотворения. Проблема сохранения у яйца способности к оплодотворению осложнена тем, что при попадании в водную среду икра рыб спонтанно активируется и теряет эту способность. В связи с этим особенно актуальным представляется изучение природы сигналов активации, а также возможности (механизмов) их ингибирования.
Разнообразные сигнальные процессы, приводящие к активации яйцеклетки, в настоящее время широко исследуются с использованием современных методов молекулярной и клеточной биологии. Главное внимание в этих работах уделяется сигнальной роли ионов кальция при активации. Повышение концентрации ионов кальция в яйце при активации может указывать на их роль в регуляции экзоцитоза кортикальных гранул, как одного из типов секреции.
Однако существует Са2+-независимая секреция. Например, секреция в тромбоцитах под действием эндогенного диацилглицерина или его искусственных аналогов форболовых эфиров может происходить и без изменения концентрации внутриклеточного кальция. Возможно, что секреторный ответ в этом случае обеспечивается за счет стимуляции протеинкиназы С. Участие форболовых эфиров в процессе активации яйцеклетки показано для разных видов животных. О возможном существовании более чем одного механизма регуляции экзоцитоза в яйцеклетке свидетельствуют экспериментальные данные многих работ. Электронно-микроскопические исследования показывают, что популяция кортикальных гранул неоднородна по строению, размеру и распределению в кортикальном слое яйца. Разные типы гранул имеют различную чувствительность к веществам, вызывающим искусственную активацию яйцеклеток. Для некоторых видов рыб отмечено, что при активации кальциевая волна ни по времени, ни пространственно не совпадает с экзоцитозом кортикальных гранул. Все это делает актуальным изучение возможной роли диацилглицеринового сигнального пути в активации яйца рыб.
Единым механизмом реализации кальциевого сигнала в клетке является связывание ионов кальция при повышении их концентрации с белками. Изучение состава и свойств кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетке и обеспечивающих кальциевую сигнализацию, позволит расширить представление о молекулярных механизмах, обеспечивающих протекание процесса активации у рыб.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение клеточных и молекулярных механизмов активации яйцеклетки рыб, определяющей начало включения программы развития. Изучались сигнальные процессы, приводящие к активации яйца, а также компоненты яйцеклетки, обеспечивающие ее реализацию.
В ходе работы были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать роль подмембранного актинового цитоскелета в процессе спонтанной активации, в частности в экзоцитозе кортикальных гранул.
2. Исследовать влияние форболовых эфиров на процесс образования оболочки оплодотворения у двух карповых рыб: вьюна (Misgurnus fossilis) и данио (Brachydanio rerio).
3. Исследовать влияние состава среды инкубации на активацию яйцеклеток вьюна (Misgurnus fossilis) и данио (Brachydanio rerio), а также влияние ингибиторов протеаз на сохранение способности к оплодотворению у яйцеклеток данных видов рыб.
4. Исследовать влияние искусственного изменения концентрации ионов кальция на процесс формирования оболочки оплодотворения у вьюна.
5. Идентифицировать кальцийсвязывающие белки, присутствующие в ооцитах данио.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В работе впервые показано, что ингибиторы протеаз лейпептин и апротинин подавляют процесс спонтанной активации у рыб. Полученные данные открывают возможность для создания искусственных сред, позволяющих длительное время сохранять икру рыб, способную к оплодотворению, что представляет большой практический интерес для развития аквакультуры.
Также впервые установлено активирующее действие форболовых эфиров на процесс формирования оболочки оплодотворения у яйцеклеток рыб.
Был разработан микрометод выделения кальцийсвязывающих белков.
Протеомный анализ выделенных белков с использованием масс-спектрометрии позволил впервые идентифицировать в виде запасенных белков ооцита аннексины А5, А13.1, А1а, А2а и белок копин III, содержащий С2-кальцийсвязывающий домен.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на коллоквиумах лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д.П. Филатова Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН; конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза» (Москва, 2001); конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2004); конференции «Молекулярные механизмы онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» (Москва, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ: 4 статьи в рецензируемых журналах и тезисы двух докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (203 источника). Работа содержит 17 рисунков и 4таблицы.
Результаты исследования и их обсуждение
Структура кортикального слоя неоплодотворенной яйцеклетки вьюна и ее изменения при спонтанной активации
Строение кортикального (поверхностного) слоя цитоплазмы яйцеклеток различается у разных видов рыб, что сказывается на особенностях протекания экзоцитоза кортикальных гранул в процессе активации. Структура кортикального слоя и кортикальных гранул яйца вьюна ранее описаны не были. На первом этапе мы изучали микроструктуру кортикального слоя яйца вьюна и ее изменения, происходящие при активации яйцеклетки в воде. Прижизненные наблюдения активированной яйцеклетки сочетались с изучением световых и электронных фотографий кортикальной области яйца до и после активации.
На рисунке 1 представлена фотография неактивированного яйца вьюна, находящегося в полостной жидкости, и того же яйца после 10 минут инкубации в воде. Неактивированное яйцо вьюна достигает 1,2 мм в диаметре, яйцевая оболочка плотно примыкает к поверхности яйца (рис. 1A). Оболочка яйца состоит из хорошо развитой zona radiatа, толщина которой составляет примерно 4 мкм, и примыкающей к ней наружной оболочки ворсинчатого строения (рис. 3A). При высоком увеличении можно видеть узкое щелевидное пространство толщиной около 0,4 мкм между плазматической мембраной и zona radiatа - перивителлиновое пространство, в котором находятся микроворсинки, отходящие от поверхности яйца (рис. 3А).
В периферическом слое цитоплазмы зрелых неактивированных яиц вьюна содержатся секреторные органеллы - кортикальные гранулы, которые
представляют собой пузырьки округлой или овальной формы диаметром от 4 до 25 мкм, окруженные мембраной, расположенные в один ряд. Гранулы разного размера распределены случайным образом. При этом в области анимального полюса присутствуют лишь единичные гранулы мелкого размера (рис. 2A).
Рис. 1. Образование оболочки оплодотворения у яйца вьюна при активации в воде. (А) - неактивированное яйцо вьюна в полостной жидкости. (Б) - яйцо вьюна через 10 минут после инкубации в воде. Масштабная линейка 1мм (А, Б).
При помещении неактивированного яйца вьюна в воду происходит экзоцитоз кортикальных гранул. При этом содержимое гранул выделяется под оболочку яйца и обводняется, что приводит к расширению перивителлинового пространства, которое при малом увеличении выглядит как прозрачная зона, отделяющая яйцевую оболочку от поверхности плазматической мембраны на значительное расстояние (рис. 1Б). За счет увеличения перивителлинового пространства, а также в результате набухания, размеры активированного яйца увеличиваются до 1,7 мм в диаметре (рис. 1Б).
Рис. 2. Полутонкие срезы яйца вьюна. (А) - интактное неактивированное яйцо вьюна в полостной жидкости. (Б) - интактное яйцо вьюна через 10 минут инкубации в воде. Кортикальные гранулы показаны стрелками. Aп - анимальный полюс яйца. Масштабная линейка 0,1 мм (А, Б).
На электронных фотографиях видно, что кортикальные гранулы, митохондрии и частицы диаметром 25-30 нм (по-видимому, рибосомы) отделены от плазматической мембраны яйца слоем фибриллярного материала толщиной 0,05-0,15 мкм (рис. 3А, Б), который представляет собой сеть актиновых микрофиламентов.
На полутонких срезах яйца, инкубированного 10 минут в воде, в периферическом слое цитоплазмы кортикальные гранулы отсутствуют (рис. 2Б). Толщина слоя актиновых микрофиламентов составляет 0,15-0,3 мкм (рис. 3Г), что превышает толщину этого слоя в неактивированном яйце (рис. 3А).
Рис. 3. Влияние инъекции фаллоидина на толщину подмембранного цитоскелета.
(А, Б) - подмембранная область интактного неактивированного яйца вьюна. (В) - подмембранная область яйца вьюна в месте инъекции 10 нл фаллоидина (1 мг/мл). (Г) - подмембранная область интактного яйца вьюна через 10 минут инкубации в воде. Стрелками и скобкой обозначена толщина слоя актиновых микрофиламентов. КГ - кортикальные гранулы. ZR - zona radiatа. Масштабная линейка 1 мкм (А, В, Г).
Масштабная линейка 0,5 мкм (Б).
Влияние изменения концентрации ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцеклетках вьюна
Участие ионов кальция в процессе экзоцитоза кортикальных гранул у вьюна мы изучали путем искусственного изменения концентрации ионов кальция в яйце. В первом варианте опытов в неоплодотворенное яйцо инъецировали раствор хелатора этих ионов - ЭГТА. Во втором случае инъецировали растворы, содержащие разные концентрации свободных ионов кальция. Об экзоцитозе кортикальных гранул судили по отхождению оболочки оплодотворения в месте инъекции, которое наблюдали под бинокулярной лупой.
В яйцеклетку вьюна инъецировали 10 нл PIPES буфера, содержащего 20 мМ ЭГТА и инкубировали 5 минут в полостной жидкости. В процессе инкубации каких-либо изменений морфологии яйцеклетки отмечено не было. Затем яйцо помещали в воду. При этом в месте инъекции ЭГТА образование оболочки оплодотворения не происходило (рис. 4Б), что мы объясняем локальным подавлением в этой области экзоцитоза кортикальных гранул. В качестве контроля в неактивированное яйцо вьюна инъецировали 10 нл 100 мМ PIPES буфера и затем активировали в воде. При этом происходило отделение оболочки оплодотворения по всей поверхности яйца (рис. 4А).