Автореферат: Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца

Обнаруженная нами активация икры рыб под действием форболовых эфиров, позволяет предположить, что процесс формирования оболочки оплодотворения может идти с участием PKC, при этом действие ее осуществляется на более поздних этапах сигнальных путей относительно процессов, связанных с активностью протеаз.

Идентификация кальцийсвязывающих белков

Включение программы развития в яйце, т.е. его активация, предполагает наличие в нем всех необходимых компонентов, запасенных в процессе оогенеза. Одним из универсальных сигнальных механизмов активации яйца у самых разных видов животных является кратковременное повышение в цитоплазме концентрации свободных ионов кальция. В частности, результаты наших экспериментов указывают на участие ионов кальция в процессе образования оболочки оплодотворения при активации у вьюна.

Роль ионов кальция в передаче сигналов в клетке определяется исключительно их взаимодействием с различными кальцийсвязывающими белками. Поэтому одной из задач наших исследований стало изучение кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетке рыб.

Ранее в нашей лаборатории было показано наличие в яйцеклетках вьюна кальцийсвязывающих белков: кальмодулина и S100, относящихся к суперсемейству EF-hand-содержащих белков (Ivanenkov et al., 1993). Были начаты исследования кальцийсвязывающих белков семейства аннексинов у вьюна. Мы продолжили исследования белков группы аннексинов у рыб на другом лабораторном объекте - данио, для которого мог быть применен метод идентификации белков с использованием масс-спектрометрии. Этот подход применим только в том случае, если имеются данные по массам триптических пептидов, полученные на основе известной аминокислотной последовательности исследуемого белка. Переход на новый объект был обусловлен тем, что, в отличие от вьюна, геном данио известен, аннотированы гены аннексинов, известна полная аминокислотная последовательность этих белков.

Общим молекулярным свойством аннексинов является их способность обратимо связываться с кислыми фосфолипидами в присутствии ионов кальция in vitro. На основе этого их свойства нами был разработан микрометод выделения аннексинов из ооцитов данио. Идентификацию выделенных белков проводили по следующей схеме: из ооцитов данио выделяли кальцийсвязывающие белки. Смесь белков разделяли методом одномерного либо двумерного электрофореза. Индивидуальные белковые пятна и полосы из гелей вырезали и исследовали методом Peptide Mass Fingerprint. При этом для повышения достоверности результатов полосу белка одной и той же молекулярной массы из разных гелей и разных выделенных образцов белков анализировали многократно.

Масс-спектрометрический анализ белковых полос одномерного и двумерного электрофореза позволил идентифицировать в ооцитах данио аннексины А5, А1а, А2а и А13.1 и копин III (табл. 2). Причем, как видно из таблицы, аннексины А13, А1 и А2 представлены только одной формой белка, хотя известно, что у данио имеются три изоформы А1 и по две А2 и А13, кодируемые разными генами.

Табл. 2. Идентификация образцов белков, выделенных из зрелых ооцитов данио кальцийзависимым переосаждением с кислыми фосфолипидами

*) Римскими цифрами обозначены фрагменты геля двумерного фореза, арабскими - одномерного, фотографии гелей не приведены.

**) В соответствии с протоколом метода достоверно иденти- фицированными считаются белки, для которых значение scores выше 50 (p<0.05).

Копины относятся к большому суперсемейству белков, содержащих кальцийсвязывающий С2-домен. Так же, как и аннексиновый домен, С2-домен белков в присутствии ионов кальция взаимодействует с кислыми фосфолипидами мембраны. Вероятно, именно это позволило выделить белок данного семейства из гомогената ооцитов данио методом, который мы разработали для выделения аннексинов. Такой метод выделения копинов ранее не был описан.

Наличие кальцийсвязывающего белка копина III в виде запасенного белка в ооцитах показано впервые.

мРНК аннексинов, запасенные в ооцитах данио

Одним из ранних событий, происходящих при активации яйца, является инициация белкового синтеза на запасенных в процессе оогенеза

мРНК. В ходе настоящей работы мы анализировали не только кальцийсвязывающие белки, но также их мРНК, наличие которых, наряду с запасенными белками в случае раннего включения трансляции, может обеспечивать протекание процессов, связанных с активацией.

Из ооцитов данио мы выделяли тотальную РНК и анализировали ее методом ОТ-ПЦР. В реакции использовали праймеры, специфичные к наиболее вариабельным 5'-концевым последовательностям аннексинов А13.1, А13.2 и А3. В ходе реакции ОТ-ПЦР для всех исследуемых аннексинов были получены одиночные ПЦР-продукты (рис. 7). Далее полосы были вырезаны из геля, образцы ДНК выделены и секвенированы. Нуклеотидные последовательности анализированных фрагментов показали их полную идентичность соответствующим участкам известных последовательностей аннексинов А13.1, А13.2 и А3.

Рис. 7. Электрофорез в 2% агарозном геле ПЦР-продуктов, полученных в ходе реакции ОТ-ПЦР с использованием тотальной РНК данио и праймеров, специфичных к 5`-концевым последовательностям аннексинов:

(А) - аннексина А13.1; (Б) - аннексина А3 (1) и аннексина А13.2 (2). К - контроль. Цифрами 500, 600 обозначен размер в парах оснований маркерной ДНК.

Таким образом, мы показали наличие в ооцитах данио мРНК А13.1, А13.2 и А3. Аннексин А13.1 был идентифицирован в ходе работы на белковом уровне в смеси выделенных белков, а для А13.2 и А3 наличие белков показано не было. Вероятно, трансляция аннексинов А13.2 и А3 происходит на более поздних стадиях развития яйца на запасенных мРНК.

Для аннексина А13 млекопитающих в эпителиальных клетках было показано существование двух сплайс-форм белка, которые отличаются друг от друга делецией 41 аминокислитного остатка (рис. 8). То, что в ходе реакции ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными для аннексинов А13.1 и А13.2, нами были получены одиночные полосы ПЦР-продуктов, длины которых соответствовали ожидаемому размеру, может свидетельствовать об отсутствии альтернативных сплайс-форм мРНК А13.1 и А13.2 в ооцитах данио.

Рис. 8. Схема экзон-интронной структуры и сайтов потенциального альтернативного сплайсинга генов аннексинов А13.1, А13.2 данио и гена А13 млекопитающих.

На рисунке представлена схема экзон-интронной структуры генов аннексина А13.1 (А) и А13.2 (Б) данио и А13 (В) млекопитающих, а также структура соответствующих генам мРНК. Серыми блоками обозначены экзоны, с указанием их размера (сверху). Белыми блоками обозначены интроны, с указанием их размера (снизу). Голубым цветом обозначены нетранслируемые 5' и 3' области мРНК аннексинов, красным - экзон, присутствующий только в мРНК изоформы b аннексина млекопитающих. AUG - место начала трансляции.

На рисунке 8 показано положение праймеров, с использованием которых были получены 5`-концевые последовательности кДНК аннексинов А13.1 и А13.2. Как видно, потенциальные участки альтернативного сплайсинга, находятся внутри области, ограниченной праймерами.

Кроме того, на других парах праймеров нами были получены полноразмерные кДНК аннексинов А13.1 и А13.2, которым соответствовали мРНК с открытой рамкой считывания. В ходе дальнейшей работы полученная полноразмерная кДНК аннексина А13.2 была клонирована и экспрессирована в бактериальной системе.

Проведенное сравнение аминокислотных последовательностей аннексинов А13.1 и А13.2 показало высокую степень гомологии двух белков. Аминокислотные последовательности аннексинов А13.1 и А13.2 имеют характерную для аннексинов структуру: высокое сходство С-концевых участков и высокую вариабельность N-концевых последовательностей. Основные различия у двух аннексинов наблюдаются в N-концевых участках белков (рис. 9). Существование таких высоко гомологичных белков являться иллюстрацией широко распространенного у рыб явления дупликации генов. Такие различия, как V9-T9 и Y11-F11 могут быть связаны с теоретически предсказуемой возможностью разной посттрансляционной модификации аннексинов А13.1 и А13.2: треонин (T) и тирозин (Y), в отличие от валина (V) и фенилаланина (F), могут фосфорилироваться разными протеинкиназами.

В отличие от рыб, у млекопитающих имеется только один ген аннексина А13 и альтернативность посттрансляционной модификации может реализоваться за счет существования разных сплайс-форм белка.

Рис. 9. Сравнение N - концевых последовательностей аннексинов А13.1 и А13.2 данио. Красным цветом обозначены аминокислотные остатки, являющиеся потенциальными сайтами фосфорилирования.

Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина А13.2

Для экспрессии белка аннексина А13.2 в клетках E. сoli была получена конструкция на основе вектора pQE30.

Рекомбинантный белок А13.2 из лизата бактерий выделяли двумя способами: методом очистки на Ni-NTA агарозе согласно протоколу фирмы «Qiagen» и методом осаждения с кислыми фосфолипидами в присутствии ионов кальция. Второй метод использовался нами для выделения нативных белков аннексинов из ооцитов данио. Используя метод переосаждения с фосфолипидами, из лизата бактерий было выделено около 1 мг рекомбинантного белка А13.2.

Заключение

На основании полученных данных по влиянию ингибиторов протеаз на процесс спонтанной активации нами предложена следующая гипотеза, объясняющая механизм спонтанной активации яйца рыб. На поверхности яйца имеются протеазы, участвующие в процессе активации яйца, возможно, за счет расщепления рецепторов, активируемых протеазами. В полостной жидкости рыб, как и в крови и тканевой жидкости, имеются эндогенные ингибиторы протеаз. При разведении полостной жидкости в условиях, когда икра попадает в водную среду во время нереста, ингибиторы перестают действовать и икра активируется протеазами. Мы предполагаем, что лейпептин и апротинин предотвращают спонтанную активацию, выполняя ту же роль, что и эндогенные ингибиторы полостной жидкости, а именно ингибируют протеазы на поверхности яйца, которые могут гидролизовать активируемые протеазами рецепторы на поверхности яйца.

В ходе проведенных экспериментов нами было показано, что форболовые эфиры в концентрации 0,1-1 мкМ вызывают образование оболочки оплодотворения у яйцеклеток вьюна и данио. Заслуживает внимания тот факт, что для яйцеклеток рыб этот эффект был обнаружен впервые. Вопрос, в какой каскад реакций и на какой именно стадии включаются форболовые эфиры в ходе процесса активации, требует дальнейшего изучения. Активирующий яйцо эффект форболовых эфиров наблюдался нами на фоне действия ингибиторов протеаз, что указывает на предшествование активирующего действия протеаз этапу, на котором действуют форболовые эфиры.

Исследование кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетках рыб, представляет особый интерес для изучения процесса активации яйца, тесно связанного с кальциевой сигнализацией. Различные кальцийсвязывающие белки в последние несколько десятилетий активно изучаются у самых разных организмов. Большое внимание уделяется белкам группы аннексинов, поскольку их внутриклеточные функции до сих пор остаются неизвестны. Идентификация кальцийсвязывающих белков в яйце как автономной клетке является первым необходимым шагом в изучении их функций. В ходе проведенной работы нами было установлено присутствие в ооцитах данио аннексинов А5, А13.1, А2а, А1а в виде запасенных белков, а также материнских мРНК аннексинов А3 и А13.2. Впервые в ооцитах данио с использованием метода масс-спектрометрии был идентифицирован белок копин Ш.

Результаты данного исследования являются оригинальными, вносят значительный вклад в изучение процесса активации яйцеклетки - одной из фундаментальных проблем биологии развития и клеточной биологии.

Выводы

1. Стабилизация актиновых микрофиламентов локально подавляет формирование оболочки оплодотворения и экзоцитоз кортикальных гранул в яйцеклетке вьюна при спонтанной активации.

2. Впервые показано участие форболовых эфиров, искусственных активаторов протеинкиназы С, в процессе образования оболочки оплодотворения яйца рыб.

3. Впервые показано, что ингибиторы протеаз лейпептин и апротинин подавляют процесс спонтанной активации яйцеклеток вьюна и данио, при этом сохраняя их способность к оплодотворению.

4. Искусственное повышение концентрации ионов кальция в яйце вьюна вызывает, а понижение подавляет образование оболочки оплодотворения.

5. В ооците данио впервые идентифицированы кальцийсвязывающие белки аннексины: А5, А13.1, А2а, А1а. Показано присутствие материнской мРНК аннексинов А13.1, А13.2 и А3.

6. Впервые в ооците данио обнаружен белок копин III, относящийся к семейству кальцийсвязывающих белков, содержащих С2-домен.

Публикации по теме диссертации

1 Ivanenkov V.V., Minin A.A. and Ozerova S.G. Phalloidin inhibits cortical granule exocytosis and ooplasmic segregation in loach eggs // Cell Differentiation and Development. 1990. V. 29. P. 21-36.

2. Минин А.А., Озерова С.Г., Хайдарова Н.В., Зарайский А.Г. Изучение белка группы аннексинов в раннем развитии рыб. II. Определение полной аминокислотной последовательности // Онтогенез. 2002. Т. 33. №4. С. 264-267.

3. Озерова С.Г., Минин А.А. Изучение белков группы аннексинов в раннем развитии рыб. IV. Идентификация кальцийсвязывающих белков в яйце данио с использованием масс-спектрометрии // Онтогенез. 2008. Т. 39. № 3. С. 222-226.