Автореферат: Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца

Во втором варианте опыта в неактивированное яйцо вьюна инъецировали 10 нл раствора, содержащего 2 мМ свободного кальция. Яйцо инкубировали в полостной жидкости. При этом наблюдалось локальное образование оболочки оплодотворения в области инъекции (рис. 4В). Активация была локальной даже при инъекции большой концентрации кальция - 10 нл буфера, содержащего 10 мМ свободного кальция (рис. 4Г). Если такие частично активированные большой концентрацией кальция яйца помещались в воду, то оболочка оплодотворения отделялась по всей поверхности яйца.

Тот факт, что инъекция кальция в неоплодотворенное яйцо, находящееся в полостной жидкости, вызывала локальное образование оболочки оплодотворения, может указывать на взаимосвязь между повышением концентрации ионов кальция и экзоцитозом кортикальных гранул. Однако обращает на себя внимание то обстоятельство, что при инъекции кальция образования оболочки оплодотворения по всей поверхности яйца не происходит.

Рис. 4. Влияние инъекции ЭГТА и Са2+ на экзоцитоз кортикальных гранул и активацию яйца.

(А) - яйцо, инъецированное 10 нл 100 мМ PIPIES буфера, инкубированное 5 минут в полостной жидкости и активированное в воде (контроль). (Б) - яйцо, инъецированное 10 нл буфера с ЭГТА (100 мМ PIPIES, 20 мМ ЭГТА, pH 7,2), инкубированное 5 минут в полостной жидкости и активированное в воде. (В) - яйцо, инъецированное 10 нл буфера с 2 мМ свободного кальция (100 мМ PIPIES, 20 мМ ЭГТА, 22 мМ CaCl2, pH 7,2), инкубированное 10 минут в полостной жидкости. (Г) - яйцо, инъецированное 10 нл буфера с 10 мМ свободного кальция (100 мМ PIPIES, 20 мМ ЭГТА, 30 мМ CaCl2, pH 7,2), инкубированное 10 минут в полостной жидкости. (_) - место инъекции. Масштабная линейка 1 мм.

Участие актиновых микрофиламентов в активации яйца: влияние фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул у вьюна

Исследования, проводившиеся ранее в нашей лаборатории, выявили, что у вьюна в кортикальном слое яйца расположена сеть актиновых микрофиламентов, состоящая из гамма-актина. В ряде работ на соматических секреторных клетках было показано, что для слияния секреторных гранул с плазматической мембраной необходима реорганизация кортикального слоя актиновых филаментов (Aunis, Bader, 1988; Cheek, Burgoyne, 1987).

В своей работе мы исследовали роль актиновых филаментов в процессе экзоцитоза кортикальных гранул в яйце вьюна с помощью микроинъекций фаллоидина - вещества, предотвращающего деполимеризацию фибриллярного актина.

В неактивированное яйцо инъецировали раствор фаллоидина в 2-4% DMSO (диметилсульфооксид). Концентрация фаллоидина составляла 0,1; 1 и 2 мг/мл. Инъецированные яйца инкубировали 5 минут в полостной жидкости, затем помещали в воду. О влиянии фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул судили по образованию оболочки оплодотворения в месте инъекции, которое наблюдали под бинокулярной лупой при малом увеличении.

Процесс экзоцитоза и реорганизацию кортикального слоя яйца регистрировали также на ультраструктурном уровне с использованием световой и электронной микроскопии области инъекции.

В качестве контроля в неактивированное, находящееся в полостной жидкости яйцо инъецировали 10 нл 2% или 4% DMSO. Затем яйца переносили в воду, при этом по всей поверхности яйца наблюдалось равномерное образование оболочки оплодотворения.

При инъекции 10 нл раствора фаллоидина в концентрации 0,1 и 1 мг/мл после активации яйца в воде наблюдалось локальное подавление образования оболочки оплодотворения в месте инъекции (рис. 5В, Г). На рисунке 5 видно, что яйцевая оболочка отделяется от поверхности плазматической мембраны по всей поверхности яйца, кроме области действия фаллоидина, размеры которой определяются количеством введенного вещества.

На полутонких срезах видно, что в области инъекции фаллоидина (левая часть яйца на рис. 5Д) экзоцитоз кортикальных гранул подавлен. Кортикальные гранулы располагаются в основном под плазматической мембраной, а некоторая часть их - в виде небольших скоплений во внутренней части яйца (рис. 5Д). В интактной области яйца (правая половина среза на рис. 5Д) кортикальные гранулы отсутствуют, что указывает на их нормальный экзоцитоз.

При инъекции больших доз фаллоидина (20 нл, 2 мг/мл) на электронных микрофотографиях можно наблюдать непрерывный слой кортикальных гранул на некотором расстоянии от плазматической мембраны (рис. 5Е).

Толщина слоя актиновых микрофиламентов в области инъекции фаллоидина составляла 0,4-1,5 мкм (рис. 3Б), что существенно выше по сравнению с толщиной этого слоя в неактивированном яйце, равной 0,05-0,15 мкм (рис. 3А).

Рис. 5. Влияние фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул.

(A) - неактивированное яйцо в полостной жидкости; (Б) - яйцо через 10 минут после инкубации в воде; (В, Г) - яйца, инъецированные фаллоидином: (В) - 10 нл, 1 мг/мл и (Г) - 10 нл, 0,1 мг/мл. (Д) - полутонкий срез яйца, инъецированного 10 нл фаллоидина (1 мг/мл). (Е) - полутонкий срез яйца, инъецированного 20 нл фаллоидина (2 мг/мл). (_) - место инъекции. Стрелками обозначены кортикальные гранулы (Д, Е).

Влияние ингибиторов протеаз лейпептина и апротинина на спонтанную активацию яйца вьюна и данио и на их последующую способность к оплодотворению

При нересте попадающая во внешнюю водную среду икра разных видов рыб через определенное время теряет способность к оплодотворению. Это связано со спонтанной активацией яйца, сопровождающейся образованием оболочки оплодотворения. В экспериментальных условиях, при выдерживании икры в какой-либо искусственной среде или в полостной жидкости, она также может утрачивать способность к оплодотворению. Характеристики процесса спонтанной активации: время активации, состав солевой среды, компоненты, предотвращающие спонтанную активацию, - значительно варьируют у разных видов рыб. В нескольких работах показана защита яйца данио от спонтанной активации в солевых физиологических растворах с декстрозой и БСА (Becker, Hart, 1999; Lee et al., 1999).

Мы изучали способность сред разного состава предотвращать спонтанную активацию яйцеклеток двух видов рыб - вьюна и данио. Для этого небольшие порции икры вьюна и данио в течение 10 минут инкубировали в средах разного состава, а также в полостной жидкости вьюна и сыворотке крупного рогатого скота. Активацию оценивали по образованию оболочки оплодотворения. Результаты опытов представлены в таблице 1.

Табл. 1. Влияние сред разного состава на образование оболочки оплодотворения у яйцеклеток вьюна и данио

*) Знаком (+) обозначены среды, в которых через 10 минут инкубации наблюдалось образование оболочки оплодотворения более чем у 90% яиц, знаком (-) - те, в которых в течение данного времени оболочка не образовывалась. цитоскелет экзоцитоз форболовый рыба

Как видно из таблицы, активация икры вьюна и данио не происходила только при инкубации в полостной жидкости и в сыворотке крупного рогатого скота, ингибирующее активацию действие которых сохранялось даже при разведении в 10 раз. Некоторые из полученных нами данных отличаются от литературных. Возможно, несовпадение результатов объясняется обнаруженным нами эффектом полостной жидкости сохранять свои ингибирующие свойства при разведении. Неоплодотворенные яйцеклетки рыб при их получении в лабораторных условиях погружены в полостную жидкость. При любых манипуляциях с яйцеклетками отделить их полностью от полостной жидкости, не повредив, невозможно. Если икру инкубировать в небольших объемах солевой среды, то ингибирующий эффект может быть обусловлен не составом среды инкубации, а действием веществ полостной жидкости. При постановке экспериментов мы брали количество тестируемой среды, более чем в 10 раз превосходящее объем взятой в опыт икры. В работах, из которых мы брали рецепты сред, количественные параметры разведения икры, к сожалению, не приводятся.

Мы также исследовали влияние ингибиторов протеаз на спонтанную активацию яиц вьюна и данио. Были использованы ингибиторы протеаз широкого действия и разной природы - лейпептин, низкомолекулярный ингибитор, и апротинин, белковый ингибитор протеаз. Влияние ингибиторов на процесс спонтанной активации оценивали по образованию оболочки оплодотворения.

Небольшие порции икры вьюна (30-50 икринок) инкубировали в солевом растворе HENKS с концентрациями лейпептина от 0,005 до 1мМ. В качестве контроля икру в тех же условиях инкубировали в растворе HENKS без лейпептина. При инкубации неоплодотворенной икры с различными концентрациями лейпептина более 90% икринок в каждой порции оставались неактивированными (у этих икринок мы не наблюдали образования оболочки оплодотворения). В контроле через 10 минут все яйца активировались. Столь же высокий процент неактивированных яиц (около 90%) был отмечен и при увеличении времени инкубации икры в среде с ингибитором до двух часов.

Рис. 6. Выживаемость зародышей вьюна, полученных из икры, инкубированной перед оплодотворением с различными концентрациями лейпептина.

Нами был экспериментально рассмотрен вопрос, сохраняет ли икра, инкубированная в солевой среде с лейпептином, способность к оплодотворению и дальнейшему развитию. Для этого небольшие порции икры, полученной от разных самок вьюна, инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов в растворе HENKS с различными концентрациями лейпептина от 0,005 до 1 мМ. В качестве контроля икру от тех же самок при тех же условиях инкубировали 2 часа в полостной жидкости вьюна. Затем икру в опыте и контроле оплодотворяли. Подсчет развивающихся зародышей производили через 24 часа после оплодотворения. Результаты опытов представлены на рисунке 6.

Процент выживших зародышей в опыте и контроле рассчитывали по формуле Nж./Nобщ. Nобщ. - количество икринок в пробе. Nж. - количество зародышей, выживших через 24 часа после оплодотворения. В контрольных опытах икру инкубировали в полостной жидкости, так как в растворе HENKS без ингибиторов протеаз икра вьюна в течение 10 минут полностью активируется и теряет способность к оплодотворению. Цифрами 1, 2, 3, 4 обозначены порции икры от разных самок.

При инкубации неоплодотворенной икры вьюна в растворе HENKS с 1 мМ лейпептина в течение суток 95-100% яиц оставались неактивированными, но при этом икра полностью утрачивала способность к оплодотворению.

Для изучения влияния апротинина на спонтанную активацию яиц вьюна использовали следующие концентрации ингибитора: 1; 0,5 и 0,25 мг на 1 мл среды. Было показано, что апротинин в указанных концентрациях предотвращает спонтанную активацию яиц вьюна. При концентрации апротинина 1 мг на 1 мл среды 85% яиц вьюна сохраняли способность к оплодотворению.

Аналогичные эксперименты были проведены на икре данио. Лейпептин в концентрации 1мМ также предотвращал спонтанную активацию икры данио. В то же время апротинин в концентрации 1мг на 1мл среды не оказывал ингибирующего эффекта на процесс спонтанной активации яиц данио.

Различия в действии апротинина на процесс спонтанной активации икры вьюна и данио можно объяснить разной доступностью и особенностями структуры протеаз-мишеней в яйце разных видов рыб. Видоспецифичность действия других ингибиторов протеаз на сохранение яйцом способности к оплодотворению была отмечена и в работах на золотой рыбке и радужной форели (Hsu, Goetz, 1993; Coffman, Goetz, 2000).

Влияние форболовых эфиров на образование оболочки оплодотворения у вьюна

Повышение в цитоплазме концентрации свободных ионов кальция рассматривают как триггер многих внутриклеточных процессов при активации. В своей работе мы изучали зависимость процесса активации не только от ионов кальция, но и от активности протеинкиназы С (PKC). Искусственными активаторами PKC являются форболовые эфиры, структурные аналоги диацилглицеролов. С помощью этих веществ исследуется роль PKC в самых разных внутриклеточных процессах. Так, было показано, что форболовые эфиры вызывают активацию яйцеклеток шпорцевой лягушки (Bement, Capco, 1989; Grandin, Charbonneau, 1991) и млекопитающих (Sun et al., 1997). Данные о влиянии форболовых эфиров на процесс активации яйца рыб в литературе отсутствуют.

Для изучения влияния форболовых эфиров на активацию яиц вьюна необходимо было в первую очередь найти среду инкубации, в которой не идет спонтанная активация. Поэтому небольшие порции зрелой неоплодотворенной икры вьюна и данио инкубировали в течение 10 минут в 2 мл полостной жидкости. Затем в полостную жидкость добавляли один из форболовых эфиров: ТФА (12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат), ФДБ (форбол-12,13-дибутират) и РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат) до концентрации 0,1-1 мкМ. Процесс активации оценивали по образованию оболочки оплодотворения. Примерно через 5 минут после добавления к икре любого из форболовых эфиров у 90-95% яйцеклеток как вьюна, так и данио наблюдалось образование оболочки оплодотворения. При этом активация под действием форболовых эфиров происходила несколько медленнее, чем в воде, что может указывать на разнокачественность процессов, происходящих в том и другом случаях.

Неактивированную икру вьюна инкубировали также 10 минут в 2мл раствора HENKS с 1 мМ лейпептина. Затем в пробу добавляли PMA до концентрации 0,1-1 мкМ, что вызывало образование оболочки оплодотворения у 95% инкубированных икринок.