Изучение гена d-глюкуронил с5-эпимеразы как возможного гена-супрессора опухолевого роста
03.00.04 - биохимия
03.00.03 - молекулярная биология
кандидата биологических наук
Прудникова Татьяна Юрьевна
Новосибирск - 2009
Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия)
Научный руководитель:
кандидат биологических наук Григорьева Эльвира Витальевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Душкин Михаил Иванович
кандидат биологических наук Катохин Алексей Вадимович
Ведущая организация:
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск.
Защита диссертации состоится «___»_________2009 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8 (383) 333-54-81).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАН.
Автореферат разослан «___» _________2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник Г.С. Русских
ген глюкуронил эпимераза опухолевый
Общая характеристика работы
Актуальность темы. В настоящее время открыто множество биологических молекул, которые участвуют в процессах злокачественной трансформации. К таким молекулам относятся и протеогликаны (ПГ) - сложные макромолекулы, состоящие из белкового кора и присоединённых к ним цепей гликозаминогликанов (ГАГ). Протеогликаны находятся на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе (ВКМ), выполняя разнообразные функции, в том числе связанные с участием в межклеточных взаимодействиях и во взаимодействиях клетки с ВКМ за счет связывания с различными компонентами ВКМ, включая факторы роста и их рецепторы (Ori et al., 2008; Lindahl et al., 2007, Santra et al., 2002). Изменения экспрессии или локализации этих молекул, так же как и ферментов, вовлеченных в их биосинтез и деградацию, ассоциированы с измениями пролиферативной активности клеток (Yip et al., 2006; Li et al., 2008), изменениями их подвижности (Gordon et al., 2008; Giordano et al., 2008) и ангиогенеза (Bix et al., 2008).
Известно, что при злокачественной трансформации меняется структура, состав, степень сульфатирования (Theocharis et al., 2003; Achilleas et al., 2002) и эпимеризации протеогликанов - замещения остатков глюкуроновой кислоты (GlcUA) на идуроновую (IdoUA) (Timar et al., 2002; Valla et al., 2001). Содержание остатков идуроновой кислоты в составе протеогликанов (ПГ) имеет важное значение для нормального функционирования гепарансульфат протеогликанов (ГСПГ) (Westergren-Thorsson et al., 1991). Показано, что содержание идуронового компонента коррелирует с антипролиферативным эффектом гепарансульфат протеогликанов - ГС, богатые остатками идуроновой кислоты (IdoUA) оказывали значительный антипролиферативный эффект на клетки мезотелиомы, тогда как ГС, имеющие в своем составе в основном остатки глюкуроновой кислоты, не имели подобного эффекта (Syrokou et al., 1999). При опухолях прямой кишки (Tsara et al., 2002), толстого кишеника (Theocharis, 2002), опухолях поджелудочной железы (Skandalis et al., 2006a) и карциномы гортани (Skandalis et al., 2006b) содержание идуроновой кислоты в углеводных цепях ГАГ версикана и декорина снижается. Изменения в структуре и соотношении GlcUA/IdoUA в опухоли могут свидетельствовать о том, что, возможно, при злокачественной трансформации происходит нарушение в процессе биосинтеза ПГ, в частности в процессе эпимеризации.
Одним из ключевых ферментов биосинтеза гепарансульфат протеогликанов является D-глюкуронил С5-эпимераза (GLCE). Этот фермент проводит реакцию эпимеризации остатков глюкуроновой кислоты в идуроновую в углеводных цепях ГСПГ, участвующих в поддержании межклеточного контакта и передаче сигнальной информации. Эпимераза является единственным ферментом биосинтеза ГСПГ о котором практически ничего не известно. До настоящего времени эпимераза изучалась исключительно как фермент биосинтеза ПГ - определена ее субстратная специфичность, кинетические свойства (Hagner-McWhirter et al., 2000b), механизмы эпимеризации глюкуронила (Prihar et al., 1980; Backstrom et al., 1979), клонирована кДНК эпимеразы из легкого быка (Li et al., 1997), мышиной печени (Li et al., 2001) и клеток мышиной мастоцитомы (Crawford et al., 2001).
Разрушение гена, кодирующего D-глюкуронил С5-эпимеразу у мыши, приводило к гибели эмбрионов, у которых были обнаружены дефекты развития почек, легких, нарушения в костной ткани (Hagner-McWhirter et al., 2004). Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия/акивность эпимеразы может иметь важное значение для правильного формирования органов.
Отсутствие других данных о D-глюкуронил С5-эпимеразе не позволяет получить представление о том, есть ли какая-либо тканеспецифичность в экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы у человека, изменяется ли экспрессия/активность этого фермента при злокачественной трансформации и существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Нами была высказана гипотеза, что при злокачественной трансформации клеток происходит нарушение экспрессии либо активности D-глюкуронил С5-эпимеразы, что приводит к изменению структуры и состава ГСПГ и пролиферативной активности клеток.
Цель данной работы: исследовать роль D-глюкуронил С5-эпимеразы в регуляции клеточной пролиферации при злокачественной трансформации.
В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:
1. Определить уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека
2. Исследовать экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в клинических образцах злокачественных и доброкачественных опухолей и культурах опухолевых клеток рака легкого, молочной и предстательной железы человека.
3. Изучить влияние экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферативную активность опухолевых клеток карциномы молочной железы (MCF7), карциномы предстательной железы (LNCaP) и мелкоклеточного рака легкого (U2020) in vitro.
4. Изучить влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на формирование экспериментальных опухолей in vivo (мыши SCID) и провести анализ ее экспрессии в выросших опухолях.
Научная новизна работы
В данной работе впервые было показано, что:
· ген D-глюкуронил С5-эпимеразы экспрессируется во всех изученных нормальных тканях человека (молочная железа, легкое, тимус, щитовидная железа, почка, кишечник, предстательная железа) и показана тканеспецифичность экспресии данного гена.
· при злокачественной трансформации ткани молочной железы и предстательной железы человека происходит снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с нормальной тканью. Снижение экспрессии гена эпимеразы детектируется даже в неизмененной ткани, окружающей опухоль молочной железы.
· восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы оказывает антипролиферативное влияние на культуру опухолевых клеток различного происхождения - культуру клеток рака молочной железы линии MCF7, рака предстательной железы линии LNCaP и мелкоклеточного рака легкого линии U2020.
· восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы оказывает супрессирующий эффект на формирование и рост экспериментальных опухолей у иммунодефицитных мышей линии SCID
Научно-практическая значимость
Полученные данные о снижении гена D-глюкуронил С5-эпимеразы не только в опухоли молочной железы, но и в неизмененной ткани, окружающей опухоль, привлекает внимание к этому гену как новому возможному маркеру доклинической диагностики рака молочной железы.
Способности эпимеразы супрессировать пролиферацию опухолевых клеток in vitro и рост экспериментальных опухолей in vivo дают основу для дальнейших исследований гена D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможного кандидата для генотерапии злокачественных новообразований.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Ген D-глюкуронил С5-эпимеразы человека экспрессируется во всех исследованных тканях человека, с наивысшим уровнем экспрессии в молочной железе и легком и меньшей экспрессией в тканях почки, тимуса и щитовидной железы.
2. В злокачественных опухолях молочной и предстательной железы человека происходит значительное снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, при гиперплазии и в доброкачественных опухолях экспрессия гена в большинстве случаев сохраняется на нормальном уровне.
3. Усиление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках при введении плазмидной конструкции, несущей полноразмерную кДНК эпимеразы, супрессирует пролиферацию опухолевых клеток in vitro для клеточных линий MCF7 (рак молочной железы), LNCaP (рак предстательной железы) и U2020 (мелкоклеточный рак легкого).
4. D-глюкуронил С5-эпимераза подавляет формирование экспериментальных опухолей in vivo у мышей SCID - при инокуляции экспрессирующих эпимеразу клетками U2020 опухоли образовались лишь у 5 из 10 экспериментальных мышей, в выросших опухолях экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы практически отсутствует.
Апробация работы
Результаты работы были представлены и обсуждены на 42ой Международной Научной Студенческой Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2004), на 8ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2004), на Российской Научно-практической конференции «современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, Россия, 2004), на Российской Научно-практической конференции «Новые технологии в онкологии» (Барнаул, Россия, 2005) , на Мировом конгрессе по онкологии и Симпозиуме по молекулярной медицине (The World Congress on Advances in Oncology, and International Symposium on Molecular Medicine, Крит, Греция, октябрь 2004, 2005, 2006, 2007, 2008), на 6ой Европейской конференции по раку молочной железы (6th Europeam Breast Cancer Conference, Берлин, Германия, 15-19 апреля 2008), на 8ой Международной конферении по исследованию рака (8th International Conference of Anticancer Research, Кос, Греция, 2008), на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная Онкология» (Новосибирск, Россия, 2008).
Публикации. По материалам диссертации имеется 15 печатных работ.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на 95 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 3 таблицы и 37 рисунков и состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, содержащего 123 зарубежных источника.
Материалы и методы исследования
Для изучения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы использовали клинические образцы нормальной ткани (косметические операции), доброкачественных опухолей (фиброаденомы), образцы из зоны опухолевого очага и наименее измененных удаленных участков молочной железы одного и того же пациента, удаленные в ходе хирургического вмешательства. Операционный материал получали в Городской Клинической Больнице N1 г. Новосибирска, забор образцов проводили под контролем главного онколога г. Новосибирска д.м.н., проф. С. В.Сидорова, диагноз верифицирован гистологическим исследованием. От всех пациентов имеется письменное информированное согласие на участие в исследовании, эксперименты соответствуют этическим принципам Хельсинкской Декларации и стандартам биоэтического комитета ГУНИИ МББ СО РАМН. Образцы опухолей и гиперплазий предстательной железы были получены из Университета Крита, Лаборатория Клинической Вирусологии, Греция. В качестве нормальных образцов использовали ткань предстательной железы, полученную от людей, погибших в результате несчастного случая.
Суммарную РНК выделяли с использованием реагента PureLink Total RNA Purification System (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. Относительное содержание мРНК GLCE определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР и количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. В качестве эндогенного внутреннего контроля были выбраны гены «домашнего хозяйства» в-актин и GAPDH. Для синтеза кДНК брали по 1 мкг РНК на пробу. Каждая проба ПЦР содержала ~100нг кДНК, 1 мкл 10x ПЦР-буфера (10 мМ Tris-HCl, 1,8 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, pH 8,3), 10 пмоль каждого праймера, 0,1 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата и 1 ед.акт. Taq-ДНК-полимеразы. Для гена эпимеразы, амплификация проводилась в течение 15 циклов, после чего в реакционную смесь добавляли праймеры для GAPDH и проводили еще 18 циклов амплификации. Каждую пробу амплифицировали трижды. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5 - 2% агарозном геле, гель окрашивали бромистым этидием и сканировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Москва). Денситометрию проводили с помощью программы ”Total Lab”(Nonlinear Dynamics, UK). Содержание мРНК GLCE оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена эпимеразы к интенсивности полосы гена «домашнего хозяйства» GAPDH.