Белок эпимеразы (68кДа) выявлялся в контрольной ткани всех пацентов с диагнозом рак молочной железы и во всех образцах фиброаденомы молочной железы (21 образец). Однако 84% опухолевых образцов показывали значительное снижение либо полное исчезновение эпимеразного белка.
Полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия эпимеразы значительно снижается в опухолях молочной железы человека, причем это можно наблюдать как на транскрипционном, так и на трансляционном уровне. Возможно, данный эффект каким-то образом связан с тенденцией окружающей опухоль ткани молочной железы к озлокачествлению - в нормальной ткани присутствует и мРНК, и белок эпимеразы, а в ткани, окружающей опухоль экспрессия мРНК может быть уже снижена, хотя белок еще детектируется. В опухоли наблюдается снижение как мРНК, так и белка эпимеразы. В случаях с доброкачественными опухолями (фиброаденомами) молочной железы у некоторых пациентов наблюдается практически полное исчезновение экспрессии эпимеразы на уровне мРНК.
Является ли снижение экспрессии эпимеразы в опухоли специфичным лишь для молочной железы, либо данный эффект проявляется в различных типах опухолей, оставалось неизвестным. Поэтому следующим этапом нашей работы был анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в злокачественных опухолях и гиперплазиях предстательной железы.
Анализ экспрессии гена D-глюкурнил С5-эпимеразы в злокачественных опухолях и гиперплазиях предстательной железы человека
Уровень экспрессии гена эпимеразы в образцах предстательной железы определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием технологии TaqMan. В исследовании использовали 5 нормальных образцов (от людей, погибших в результате несчастного случая), 42 клинических образца злокачественных опухолей предстательной железы (карциномы предстательной железы) и 41 образец гиперплазии предстательной железы (Рис.10) .
Рисунок 10. Диаграммы изменения экспрессии GLCE методом ОТ-ПЦР в реальном времени в опухолевых образцах предстательной железы человека и гиперплазиях.
Согласно полученным данным, снижение экспрессии гена эпимеразы происходило у 46% пациентов со злокачественными опухолями предстательной железы и лишь у 7% пациентов с доброкачественными новообразованиями (более чем в 2 раза по сравнению с нормальной тканью). Остальные образцы имели уровень экспрессии эпимеразы, сопоставимый с нормой либо выше нормального.
Таким образом, было показано, что уровень экспрессии гена эпимеразы снижается в опухолях не только молочной железы, но и предстательной железы. Возможно, что ген эпимеразы каким-то образом вовлечен в процесс злокачественной трансформации, и снижение экспрессии или активности этого фермента играют важную роль в индукции опухолевого роста.
Поэтому следующим этапом данной работы было изучение влияния восстановления экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферативную активностькультуры опухолевых клеток in vitro и на формирование опухолей in vivo.
Ген-инактивирующий тест (GIT - Gene Inactivaion Test)
Для изучения функциональной роли D-глюкуронил С5-эпимеразы в процессе злокачественной трансформации был использован специальный тест, основанный на эффекте инактивации супрессорных генов в растущих экспериментальных опухолях (GIT - Gene Inactivation Test).
Этот тест был специально разработан для проверки способности разных генов супрессировать развитие злокачественных опухолей in vivo (т.е. быть отнесенным к классу генов, супрессирующих развитие опухоли - Tumour Suppressor Gene - TSG).
Его основная идея заключается в следующем - клетки раковой линии трансфецируются плазмидой, несущей исследуемый ген (А). Затем отбирают стабильно трансфецированные клоны (Б), которые инокулируют мышам линии SCID (Severe Combined Immunodeficiency) (В). Далее проводят анализ выросших опухолей (ПЦР, Вестерн блоттинг, иммуногистохимический анализ) (Г) и сравнение экспрессии исследуемого гена в клетках до инокуляции и в выросших из них опухолях (Д) (Рис.11).
Основным критерием определения гена как TSG является факт исчезновения его экспрессии в экспериментальной опухоли: если ген является супрессором, то его экспрессия в опухолевых клетках будет тормозить их пролиферацию и опухоли не должны развиваться. Если опухоли вырастают, то значит, ген каким-то образом был инактивирован (например, произошла мутация или делеция).
Рисунок 11. GIT - Ген инактивирующий тест (Gene Inactivation Test) (Protopopov et al., 2002).
Для того, чтобы изучить возможный эффект восстановления экспрессии гена эпимеразы на пролиферацию опухолевых клеток in vitro и развитие экспериментальных опухолей in vivo, ген D-глюкуронил С5-эпимеразы был клонирован в экспрессирующие эписомальные вектора pETE/Bsd и pCEP4.
Для этого полноразмерная кДНК эпимеразы была амплифицирована с плазмиды KIAA-00836-pBluescript (Kazusa DNA Research Institute, Japan), содержащей фрагмент кДНК эпимеразы, укороченный с 5'-конца. Для реакции амплификации был синтезирован длинный олигонуклеотид, который использовался в качестве прямого праймера при наработке ДНК эпимеразы методом ПЦР (Рис. 12).
Pисунок 12. Схема клонирования D-глюкуронил С5-эпимеразы в векторa pETE/BSD и pCEP4.
Далее проводилась рестрикция вектора pETE и наработанного фрагмента ДНК эпимеразы по сайтам NotI и BglII и их лигирование. Для переклонирования гена эпимеразы из вектора pETE/BSD в вектор pCEP4 фрагмент ДНК эпимеразы нарабатывался с использованием ПЦР с матрицы epi-pETE/BSD, далее проводилась рестрикция вектора pCEP4 и ДНК эпимеразы, и их лигирование.
Последовательность D-глюкуронил С5-эпимеразы в конечных конструкциях была подтверждена секвенированием. Полученные конструкции со вставкой гена D-глюкуронил С5-эпимеразы обозначались как epi-pETE и epi-pCEP4.
Влияние экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост стабильно трансфецированных клонов.
Полученные конструкции epi-pETE/Bsd и epi-pCEP4 были использованы для восстановления экспрессии эпимеразы в клетках мелкоклеточного рака легкого линии U2020, клетках карциномы молочной железы линии MCF7 и клетках карциномы предстательной железы линии LCNaP. Была проведена трансфекция клеточных линий U2020 и LNCaP конечной конструкцией epi-pETE/Bsd, полученные клоны были обозначены как epi-U2020 и epi- LCNaP. Трансфекцию клеточной линии MCF7 проводили конструкцией epi-pCEP4, полученные клоны были обозначены как epi-MCF7. В качестве контроля проводили трансфекцию пустыми векторами pETE/Bsd и pCEP, полученные клоны обозначали как pETE-U2020, pETE-LCNaP, pCEP-MCF7.
После трансфекции были отобраны стабильные клоны, наличие экспрессии эпимеразы в которых было проверено методом мультиплексной ОТ-ПЦР (Рис. 13А).
Рисунок 13. Влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферацию опухолевых клеток in vitro. А. Электрофореграмма экспрессии гена эпимеразы в стабильных клонах по сравнению с иходными клеточными линиями. Наибольшей экспрессией обладают epi-MCF7 клон 3, epi-LNCaP клон 5, epi-U2020 клоны 4, 7, 8. Б. Кривые пролиферации стабильных клонов epi-MCF7 1, 3, 4, pCEP4-LCNaP, 5, epi-U2020 4, 7, 8 с использованием CyQUANT NF Cell Proliferation Assay
Восстановленный уровень экспрессии эпимеразы в клонах epi-MCF7 кл.3, epi-LNCaP кл.5 и epi-U2020 кл. 4 , кл.7 и кл.8 был значительно выше, чем в контрольных клонах с пустыми векторами (Рис. 13 А).
Стабильные клоны с наивысшей экспрессией эпимеразы были использованы для определения пролиферативной активности клеток методом CyQUANT NF Cell Proliferation Assay (Invitrogen), позволяющим определять содержание клеточной ДНК при связывании ее со специфическим флуоресцентным красителем. Измерения флуоресценции проводились каждые 24 часа и по полученным данным строили прямую линию, угол наклона которой и определяет скорость клеточного деления (Рис. 13 Б).
Из приведенных графиков видно, что во всех клеточных линиях эпимераза тормозила скорость деления клеток in vitro, хотя и в разной степени. Поскольку снижение пролиферации наблюдалось в клеточных линиях различного гистохимического происхождения (мелкоклеточного рака легкого линии U2020, клетках карциномы молочной железы линии MCF7 и карциномы предстательной железы линии LCNaP), то можно предположить, что D-глюкуронил С5-эпимераза может обладать ткане-неспецифичным антипролиферативным эффектом.
Для подтверждения возможной антипролиферативной активности D-глюкуронил С5-эпимеразы необходимо было провести эксперименты in vivo.
Изучение влияния экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост экспериментальных опухолей in vivo
Влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на развитие опухоли in vivo было изучено методом инокуляции суспензии опухолевых клеток, стабильно трасфецированных плазмидой epi-pETE\Bsd, иммунодефицитным мышам линии SCID (дефицит Т-клеток у SCID связан с дефектом процесса рекомбинации рецепторных генов). Для инокуляции были отобраны клоны epi-U2020 с максимально выраженным усилением экспрессии эпимеразы (клоны 4,7,8). В качестве контроля использовали клетки, несущие пустой вектор - pETE-U2020 (Рис. 14).
Рисунок 14. Влияние эпимеразы на рост опухолей у иммунодефицитных мышей линии SCID. Для инокуляции использовали три различных epi-U2020 стабильных клона (4, 7 and 8), в качестве контроля - клетки, несущие пустую плазмиду pETE-U2020. Измерения размера опухолей (мм3) проводились в течение 35 дней.
Практически все экспериментальные опухоли epi-U2020 росли значительно медленнее по сравнению с контрольными (Рис. 14) либо не вырастали вообще.
В течение 35 дней опухоли были выявлены у 5 из 6 контрольных мышей, инокулированных клетками pETE-U2020. У экспериментальных мышей, инокулированных клетками epi-U2020 клонов образовались лишь 5 опухолей из 10 (Рис. 15).
Рисунок 15. Влияние эпимеразы на формирование экспериментальных опухолей у мышей линии SCID. Сформировалось 5 опухолей у 6 контрольных мышей и 5 у 10 экспериментальных.
Анализ экспериментальных опухолей
Экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолях, выросших у мышей SCID, проверяли методами полуколичественной мультиплексной ОТ-ПЦР и количественной ОТ-ПЦР в реальном времени (Рис. 16).
Рисунок 16. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в экспериментальных опухолях. А. Электрофореграмма мультиплексной ОТ-ПЦР, в качестве внутреннего стандарта использовали ген GAPDH. Б.Относительная экспрессия гена эпимеразы по отношению к GAPDH. Подписи на графике соответствуют дорожкам на электрофореграмме. Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD.
Уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в выросших опухолях был значительно ниже, чем в исходных клетках epi-U2020, использованных для введения SCID мышам. Результаты количественной ПЦР в реальном времени подтвердили данные мультиплексной ОТ-ПЦР - экспрессия эпимеразы в опухолях, выросших из epi-U2020 клеток практически полностью отсутствовала, при уровне экспрессии 720-960 молекул эпимеразы/1000 молекул GAPDH в исходных клетках, использованных для инокуляции.
Наличие белковой молекулы эпимеразы в опухолях, выросших у SCID мышей, определялось с помощью иммуногистохимического исследования опухолей с использованием анти-эпимеразной поликлональной сыворотки (GenScript Corp., USA) (Рис. 17).
А.
Б.
Рисунок 17. Иммуногистохимический aнализ экспериментальных опухолей, выросших у SCID мышей.
Синим окрашены ядра (гематоксилин). Коричневым окрашена белковая молекула эпимеразы. Первичные антитела - поликлональная сыворотка. Вторичные антитела (anti-rabbit)- HRP антитела. Окраска ДАБ и гематоксилином. A. Гистологический срез опухоли, выросшей из клеток исходной клеточной линии U2020, содержащих пустую плазмиду. Б. Гистологический срез опухоли, выросшей из клеток эпимераза-U2020, 4 клон.
Было продемонстрировано, что в опухолях белок D-глюкуронил С5-эпимеразы не детектируется (рис. 17 А, Б).
Полученные данные согласуются с результатами ОТ-ПЦР анализа о снижении уровня мРНК эпимеразы в экспериментальных опухолях по сравнению с уровнем мРНК в клонах, использованных для инокуляции мышам SCID. Это подтверждает наше предположение о том, что в опухолях происходит инактивация GLCE, что по-видимому, является необходимым условием развития опухоли, и, следовательно, ген D-глюкуронил С5-эпимеразы может являться потенциальным геном, супрессирующим развитие опухоли.
В целом, полученные данные свидетельствуют в пользу возможного супрессорного эффекта гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферацию опухолевых клеток и развитие опухоли. Наличие такого эффекта привлекает внимание к этому гену как возможному гену-супрессору развития опухоли и новому участнику механизмов регуляции пролиферативной активности клеток.
Заключение
В настоящем исследовании впервые было начато изучение функциональной роли гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в процессе злокачественной трансформации. Мы показали значительное снижение экспрессии гена эпимеразы в опухолях молочной и предстательной желез.
Особенный интерес вызывает то, что снижение экспрессии гена эпимеразы можно детектировать уже на ранних стадиях опухолевой патологии молочной железы: у большинства исследованных пациентов наблюдалось снижение уровня мРНК эпимеразы даже в неизмененной окружающей опухоль ткани.
Такой эффект характерен для так называемых генов супрессоров опухолей (TSGs - Tumor Suppressor Genes), для большинства из которых показано, что они должны быть инактивированы либо делетированы в растущих опухолях для того, чтобы опухолевые клетки могли преодолеть механизмы, контролирующие клеточное деление.