С помощью обычного электрофореза получают 5 стандартных фракций: альбумины и четыре фракции глобулинов:α1- α2- β- и γ-.
Альбумин. Сывороточные альбумины присутствуют в наибольших концентрациях по сравнению с другими белками плазмы. Они представляют собой мономерные белки, с М. около 69 кДа, в молекуле имеется 3 функциональных домена с гомологией аминокислотной последовательности. Каждый домен содержит 6 дисульфидных мостиков. Относительно небольшая молярная масса и высокая плотность отрицательных зарядов определяют важность альбуминов в поддержании осмотического давления. Альбумины выполняют и транспортную функцию: переносят растворимые метаболиты, кальций, свободные жирные кислоты. Альбумин как транспортный белок обладает большой емкостью и низкой аффинностью для многих веществ, в частности для тиреоидных гормонов, кальция и жирных кислот. Он также связывает неконъюгированный билирубин.
Гипоальбуминемия может вызываться физиологическими и патологическими причинами. Среди физиологических причин основной являются поздние сроки беременности, при которых объем распределения белка увеличивается. Патологические причины включают нарушение синтеза, увеличение объема распределения, а также потерь белка. Нарушение синтеза альбуминов очень редко встречается в наследственной форме, чаще причинами становятся недостаточное питание и хронические заболевания печени. Наиболее выраженная гипоальбуминемия выявляется при портальном циррозе, жировой дистрофии печени. При панкреатических циррозах, хронических гепатитах снижается фракция альбуминов, но увеличиваются фракции β- и γ-глобулинов. Снижение концентрации альбуминов может наблюдаться при длительных механических желтухах, опухолях печени, токсических гепатитах вследствие диффузной белковой дистрофии клеток печени. Изменения распределения альбуминов связаны с увеличением проницаемости капилляров и уходу части белка в лимфу. Это наблюдается как при некоторых заболеваниях печени (циррозы), так и после травм, оперативных вмешательств, тяжелых ожогов и инфекций. В последнем случае происходит также усиление катаболизма белков. Состояния увеличенных потерь белка характерны для заболеваний почек, желу- дочно-кишечного тракта (ЖКТ), небольшие потери наблюдаются при воспалительных процессах.
Существуют несколько молекулярных форм альбумина. При редком наследственном заболевании бисальбуминемии в плазме встречается разновидность белка, отличного от обычного по электрофоретической подвижности, что приводит к появлению двух альбуминовых полос при электрофорезе. Клинически это состояние никак не проявляется и обнаруживается, как правило, случайно.
Ряд белков плазмы имеет важное транспортное значение. Трансферрин – основной белок, транспортирующий железо. Относится к фракции
46
β-глобулинов, представляя собой основной белок этой фракции, количество которого составляет 2,0-2,3 г/л. В норме около 30% белка связаны с железом, причем каждая молекула несет два атома этого металла. Функция его состоит в транспорте железа из кишечника, перераспределении железа, предотвращении накопления Fe3+ в тканях и обеспечении синтеза гемовых структур в количестве, необходимом клеткам и организму в целом. Период полураспада трансферрина меньше, чем у альбумина и концентрация белка очень чувствительна к обеспеченности аминокислотами (то есть к полноценности питания). Концентрация трансферрина снижается, кроме несбалансированного питания, при заболеваниях печени, воспалительных процессах. Дефицит железа сопровождается увеличением скорости синтеза белка в гепатоцитах. Количественное определение трансферрина используется для измерения железосвязывающей емкости сыворотки крови. Повышение содержания трансферрина наблюдается у беременных женщин и больных с недостатком железа в организме. Гаптоглобины относятся к фракции α2-глобулинов. Это группа белков, связывающих гемоглобин, освобождающийся при внутрисосудистом гемолизе эритроцитов. Образующийся комплекс гемоглобингаптоглобин элиминируется клетками ретикулоэндотелиальной системы. Так как это сопровождается снижением концентрации гаптоглобина в плазме, определение концентрации гаптоглобина используют для регистрации внутрисосудистого гемолиза и оценки его интенсивности. Однако низкое содержание в плазме гаптоглобина также обнаруживается при хронических заболеваниях печени за счет уменьшения скорости синтеза данного белка. Гаптоглобин относят к белкам острой фазы воспаления (см. предыдущую главу) и его содержание возрастает при развитии острого воспалительного процесса. Гаптоглобины имеют выраженный генетический полиморфизм. Молекула гаптоглобина состоит из двух типов субъединиц – α и β. Строение β-цепей консервативно, тогда как для α-цепей существуют три аллели. Разные по α- цепям белки функционально сходны. Концентрация гаптоглобина в норме составляет в сыворотке 0,3-1,9 г/л. Гемопексин (относится к фракции β- глобулинов) связывает гем и предотвращает его экскрецию почками. Комплекс гем-гемопексин улавливается печенью, где железо вновь используется для синтеза гемовых структур. Концентрация гемопексина уменьшается при гемолизе, болезнях печени и почек и увеличивается при воспалительных процессах. Ретинолсвязывающий белок выполняет функцию транспорта ретинола, относится к фракции α1-глобулинов, однако в норме циркулирует в комплексе с преальбумином. Синтез данного белка зависит от обеспеченности аминокислотами, его концентрация нарушается при несбалансированном питании. Он имеет низкую молекулярную массу (21 кДа), поэтому может фильтроваться гломерулами и реабсорбируется почечными канальцами. Транскортин транспортирует стероидные гормоны, есть также белок, связывающий кобаламин (он синтезируется в клетках слизистой желудка), α и β- глобулины, транспортирующие липиды. Липопротеины, их состав, функции,
47
синтез и механизмы взаимодействия с клеткой будут рассмотрены в главе, описывающей нарушения обмена веществ. Фибронектин представляет собой полифункциональный адгезивный гликопротеид с М. 440 кДа. Синтезируется в печени и фибробластах в форме димера. Две полипептидные цепи соединены на С-конце двумя дисульфидными мостиками. Такие же мостики имеются и внутри цепей. Фибронектин обладает специфическими доменными структурами для взаимодействия с рядом рецепторов плазматических мембран клеток, с С1g компонентом комплемента, коллагеном, фибриногеном, ДНК. Уровень фибронектина в плазме у мужчин в норме составляет 300 мг/л, а у женщин – 250 мг/л. Количество белка медленно нарастает с возрастом, имеет индивидуальные отличия, обусловленные группой крови и другими факторами. Наиболее известная функция фибронектина – очищение крови от чужеродных продуктов распада белков и клеток посредством их опсонизации (образования комплексов). Образовавшиеся комплексы захватываются гепатоцитами и разрушаются в них. Фибронектин плазмы относится к белкам с высокой скоростью обновления, период обновления всего фибронектина плазмы обычно равен 30-36 часам. Внеплазменный фибронектин синтезируется в фибробластах и входит в состав экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани. В ряде патологических состояний наблюдается снижение уровня фибронектина в крови за счет ускорения его утилизации при неизменной скорости синтеза (сепсис, ожоги, потеря крови) или за счет снижения скорости производства (циррозы, печеночная недостаточность). В клинической практике применяется как критерий оценки выживаемости больных, но методы определения количества фибронектина достаточно сложны: иммунологические, хроматографические. Белки острой фазы воспаления. В период воспаления в плазме крови фиксируется увеличение содержания белка за счет увеличения синтеза таких белков, как: С-реактивный белок, ингибиторы протеаз, α1 - кислый гликопротеин, гаптоглобин и др. Эти белки объединяют под названием белков острой фазы. С-реактивный белок назван так в связи со способностью образовать прочный комплекс с С-полисахаридом клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Белок синтезируется, по-видимому, макрофагами и только при их активации, так как в норме в плазме не обнаруживается. Появление и увеличение содержания С-реактивного белка характерны для многих инфекционноаллергических заболеваний, например для ревматоидных. Функция этого белка до конца не изучена, предполагается, что он способствует фагоцитозу фрагментов бактериальных клеток, увеличивает подвижность лейкоцитов, активирует ряд иммунных реакций и, в частности, связывание комплемента. Уровень α1- кислого гликопротеина возрастает в ответ на острые и хронические воспалительные процессы. Функции этого белка изучены недостаточно. Ингибиторы протеаз играют важную роль в процессах свертывания крови, фибринолиза, в иммунных реакциях, кининогенезе и регуляции кровяного давления. В плазме крови обнаружено восемь ингибиторов протеаз: α1-антитрипсин, α2-макроглобулин, антитром-
48
бин III, α2-антиплазмин, ингибитор первого компонента комплемента, α1- антихемотрипсин, интер- α-ингибитор трипсина, ингибитор активации плазминогена.
Одним из важнейших плазменных ингибиторов протеаз является α2-макроглобулин, регулирующий активность различных протеолитических ферментов крови и тканей [5,6,7]. Согласно данным [Steibuch M., 1979; James K., 1980, цит.6], содержание α2-макроглобулина в плазме крови взрослых людей составляет 2,6-3,3 г/л, его количество варьируется в зависимости от возраста и пола. Уровень белка в плазме крови у женщин на 20% выше, чем у мужчин. У детей 1-3х лет содержание α2-макроглобулина выше и равно 4,5 г/л. Описаны три различные полиморфные формы этого белка у человека. Они отличаются электрофоретической подвижностью, и наследование их осуществляется по аутосомнодоминантному типу [Harpel P.S., 1975, цит.7]. Для определения α2-макроглобулина используют иммунологические и энзиматические методы. Первые основаны на применении специфических антисывороток, вторые – на способности белка образовывать комплекс с трипсином, не чувствительный к ингибитору из бобов сои [4]. Установлено, α2-макроглобулин представляет собой гликопротеид
сМ. 725 кДа. Молекула его состоит из двух нековалентно связанных субъединиц, связанных между собой дисульфидными связями. При взаимодействии с трипсином последний образует мостик между двумя фрагментами
молекулы α2-макроглобулина и способствует стабилизации его четвертичной структуры. Связывание протеаз по данным Салвесена [Salvesen G.S., Barret A.J., 1980, цит.7], осуществляется определенным фрагментом субъ-
диницы α2-макроглобулина, не затрагивая каталитически активного центра фермента. Вероятно, при комплексовании α2-макроглобулина с протеазой происходит ограниченный протеолиз в молекуле ингибитора, которая подвергается конформационным изменениям, вследствие чего фермент не может взаимодействовать с высокомолекулярными субстратами [Barret
a.J., Starkey P.H., 1973, цит.6]. Важно, что с α2-макроглобулином взаимодействуют только каталитически активные формы протеаз. Известно, что
α2-макроглобулин обладает широким спектром действия и может взаимодействовать с протеазами различных подклассов КФ 3.4.21-24, включая металлопротеазы и SH-ферменты. Белок взаимодействует с сериновыми протеазами – трипсином, α-химотрипсином, плазмином, тромбином, калликреином, активатором плазминогена, урокиназой и др. Он реагирует со следующими тиоловыми и карбоксильными ферментами – папаином, фицином, бромелаином, катепсинами B и D. Из металлопротеаз
α2-макроглобулин образует комплексы с коллагеназой и арвином, выделенным из яда некоторых змей. Все указанные ферменты в комплексе
сданным белком либо полностью утрачивают активность, либо обладают низкой протеолитической активностью, однако сохраняют большую часть эстеразной и амидазной активностей [5,6,7].
49
α2-Макроглобулин обладает уникальным действием ограничения субстратной специфичности большинства протеолитических ферментов, при этом протеазы превращаются в пептидазы и гидролизуют низкомолекулярные пептиды, являющиеся медиаторами воспалительных процессов. Помимо регуляции активности протеаз одной из предполагаемых функций белка в связи с его высокой реакционной способностью является удаление активированных ферментов протеолиза из кровотока. Кроме того, α2-макроглобулин идентифицирован как цинксвязывающий белок плазмы человека [Adham N.F., Sang M.K., 1977, цит. 7]. Нативный белок содержит 320-770 мкг цинка на 1 г белка. α2-Макроглобулин в комплексе с протеазой способен связываться с мембранами клеток ретикулоэндотелиальной системы (лимфоцитами, полиморфоядерными лейкоцитами, макрофагами). При этом изменяются реакции лимфоидных клеток на разнообразные стимулы: хемотоксические, митогенные факторы, лимфокины, лектины и чужеродные антигены [James K., 1980, цит.7]. Например, он подавляет хемотактическую реакцию моноцитов в ответ на воздействие активаторов плазминогена и калликреина, тормозит реакцию нейтрофилов на компоненты комплемента С3а и С5а [Buffe D., Rimbaut C., 1975, цит.7]. В больших количествах α2-макроглобулин подавляет синтез и секрецию фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, который продуцируется сенсибилизированными лимфоцитами. Благодаря высокой реактивности, белок обладает способностью связывать лимфокины – растворимые соединения, образующиеся при взаимодействии сенсибилизированных лимфоцитов со специфическим антигеном.
В связи с важной ролью белка в регуляции активности протеолитических ферментов плазмы крови уровень α2-макроглобулина имеет диагностическую ценность. Увеличение концентрации α2-макроглобулина наблюдается при воспалительных процессах; у нефротических больных (параллельно с возрастанием уровня антитромбина III); у больных с сахарным диабетом при нарушениях функций почек; в период интенсивной репарации при ранениях, ожогах, лучевой болезни; при злокачественных новообразованиях. Установлена также прямая корреляция между увеличением уровня белка и метастазированием опухоли. Показана возможность использования белка для стимуляции репаративных процессов при лучевой болезни и других патологических состояниях [5].
Специфическим ингибитором плазмина в плазме крови служит α2-антиплазмин. Он представляет собой одноцепочечный гликопротеин с М. 67 кДа, содержащий 13% углеводов (сиаловые кислоты, гексозы, глюкозамин). Белок имеет в своем составе три дисульфидных мостика. α2-Антиплазмин – ассиметричная, высокогидратированная молекула, состоящая на 16% из α-спиралей, 19% β-структур и 65% неупорядочной спиральной конформации. По аминокислотной последовательности выявляется слабая гомология с антитромбином III и α1-антитрипсином. Кроме плазмина α2-антиплазмин образует комплексы с трипсином, роль его как ингибитора
50