Материал: Кленова Н.А. Биохимия патологических состояний

Б. Трансферазы

Орнитилкарбомоилтрансфераза (К.Ф. 2.1.3.3)/ Ключевой фермент.

цикла мочевины. Осуществляет перенос карбомоильной группировки с карбомоилфосфата на орнитин с образованием цитруллина:

H2N-(CH2)3-CH-COOH + H2N-CO~O-PO3H2

Имеет диагностическую ценность, поскольку цикл мочевины осуществляется только в гепатоцитах. Повышение активности в плазме регистрируется при заболеваниях печени. В норме в сыворотке обнаруживается низкая активность. Оптимум рН варьирует от 6,7 до 7,15. Относительно стабильный фермент, в плазме долго сохраняет свою активность. Устойчив к замораживанию-оттаиванию, ингибируется п-хлормеркуриобензоатом, что свидетельствует о наличие функциональных сульфгидрильных групп в активном центре фермента.

Методы определения активности сложны, применяются радиоактивные изотопы, колориметрический метод очень трудоемок, требует инкубирования сыворотки с цитруллином и арсенатным буфером в течение 24 часов. Затем белок осаждают и определяют ионы аммония по реакции с фенолгипохлоритом.

Клиническое применение. Повышение активности – инфекционный ге-

патит (максимум в период появления желтухи), цирроз (очень высокие значения активности), злокачественные опухоли, токсические поражения печени. Является очень чувствительным тестом-индикатором токсичности различных веществ по отношению к печени. Однако ввиду сложности определения в клинической практике используется редко.

γ-Глутамилтрансфераза (К.Ф. 2.3.2.1). Катализирует перенос γ-глутаминовой группы с γ-глутамилпептида на акцепторный пептид или L-аминокислоту. Активность обнаруживается в ряде органов человека: почках, печени, поджелудочной железе. Имеется несколько изоферментных форм. В норме определяется активность наиболее быстрого изофермента, при гепатите и механической желтухе увеличивается содержание более медленных изоферментов. Локализован фермент в микросомах, принадлежит к частично индуцибельным формам, синтез индуцируется этиловым спиртом и некоторыми лекарственными препаратами. γ-Глут- амилтрансфераза менее чувствительный фермент к нарушениям гепатоцитов, чем аминотрансферазы, однако его активность в плазме заметно повышается при механической желтухе, панкреатите и раке печени, тогда как

66

активность аминотрансфераз в данном случае – норма. Некоторые исследователи отмечают увеличение активности этого фермента в плазме сразу после инфаркта миокарда, но так как в кардиомиоцитах его почти нет, это скорее всего вторично и связано с повреждением при инфаркте гепатобилиарной системы.

Rosalki и Rau (1972)[17] показали, что у лиц, страдающих чрезмерным потреблением алкоголя, сывороточный уровень γ-глутамилтрансферазы коррелирует с потреблением алкоголя и является более чувствительным показателем нарушения функции печени, чем активность аминотрансфераз.

Для определения активности (Rosalki, 1970) используют смесь субстратов γ-глутамил-п-нитроанилида и глицилглицина в трис-буфере с рН 9,0. После добавления сыворотки смесь инкубируют 30 минут при 370С. Реакцию останавливают добавлением уксусной кислоты и регистрируют изменение оптической плотности λ405 нм, ξ= 9900 М-1см-1.

Аспартатаминотрансфераза (К.Ф. 2.6.1.1). Катализирует трансами-

нирование аспарагиновой кислоты в оксалоацетат. Аминогруппа переносится на α-кетоглутаровую кислоту с образованием глутаминовой:

L-Аспартат + α-Кетоглутарат ↔ L-Глутамат + Оксалоацетат

Трансаминирование играет ключевую роль в промежуточном метаболизме, так как обеспечивает и синтез, и разрушение аминокислот в клетке. Особенно активно превращаются путем трансаминирования три аминокислоты: глутаминовая, аспарагиновая и аланин. Они трансаминируются в соответствующие кетокислоты: α-кетоглутаровую, щавелевоуксусную и пировиноградную, которые могут включаться в цикл Кребса. Трансаминирование обеспечивает аспартатом цикл мочевины в гепатоцитах.

Коферментом аминотрансфераз (трансаминаз) служит пиридоксальфосфат, который осуществляет перенос аминогруппы за счет способности образовывать пиридоксаминовые производные с аминокислотами. Пиридоксальфосфат замещает аминогруппу аминокислот-субстратов на карбонильную второго субстрата с промежуточным образованием Шиффовых оснований.

Аспартатаминотрансфераза (АсАТ) – высокоспецифичный фермент, аспартат и оксалоацетат могут быть заменены только на цистеат и кетомаланат соответственно, но реакция идет с очень низкой скоростью. Это достаточно широко распространенный фермент в тканях человека, наиболее богаты этим ферментом гепатоциты, кардиомиоциты, миоциты, нефроциты. Также АсАТ содержится в тканях поджелудочной железы, селезенки, легких, но в значительно меньших количествах. Уровень активности в эритроцитах низкий и слабый гемолиз не оказывает влияния на величину плазменной активности.

67

Определение активности этого фермента в плазме после инфаркта миокарда (La Due et.all., 1954, цит.2) послужило толчком к развитию диагностической клинической энзимологии. В настоящее время это наиболее часто используемый в диагностике ферментативный тест.

При электрофорезе обнаруживаются в экстрактах из кардиомиоцитов

игепатоцитов две основные фракции фермента. Источником катионного изофермента являются митохондрии, анионного изофермента – цитоплазма. Они отличаются по каталитическим константам: оптимуму рН, Кm

ииммунохимическим свойствам. Цитозольные изоферменты из различных клеток идентичны, так же как и митохондриальные.

Вплазму в большом количестве поступает обычно цитозольный изофермент, появление митохондриального – свидетельство значительного повреждения клеток (некроз при инфаркте миокарда).

Определение активности. Методика основана на реакции пирувата с 2,4-динитрофенилгидразином. Оксалоацетат ингибирует фермент, поэтому необходимо, чтобы в ходе реакции он не накапливался. Необходимо избегать фосфатный буфер, ионы фосфата ингибируют митохондриальный изофермент. Метод унифицирован, для определения активности используются наборы реактивов. Существенным недостатком стандартных наборов является относительная нестабильность субстратных смесей, при хранении в них накапливается пируват за счет протекания химической реакции между субстратами.

Клиническое применение. Широко используется для подтверждения диагноза инфаркта миокарда, заболеваний печени и мышц. После инфаркта миокарда уровень активности АсАТ повышается в 4-5 раз и сохраняется в течение 3-5 дней от начала заболевания. При заболеваниях печени наиболее высокие уровни активности дает острый гепатит (в 50 раз от нормы), цирроз. Общая активностьАсАт повышается такжепри мышечнойдистрофии.

Аланинаминотрансфераза (К.Ф. 2.6.1.2). Также широко распространенный фермент, но самое большое количество его содержится в гепатоцитах. Имеет наибольшее диагностическое значение для регистрации повреждений тканей печени. Обратимо катализирует реакцию превращения L-аланина в пировиноградную кислоту:

L-Аланин + α-Кетоглутарат ↔ Пируват + L-Глутамат

Коферментом аланинаминотрансферазы (АлАТ) служит пиридоксальфосфат, фермент проявляет высокую специфичность по отношению к субстратам. В настоящее время отсутствуют данные об изоферментных формах. Для определения активности используется стандартный унифицированный метод, в основе которого реакция пирувата с 2,4- динитрофенилгидразином.

68

Клиническое применение. Высокая активность характерна для заболеваний печени: гепатиты, циррозы, токсические повреждения печени (ядами, химикатами, лекарственными препаратами, токсинами, образующимися в организме при инфекционных заболеваниях и распаде злокачественных опухолей). Широко используемый в клинической практике тест.

Креатинфосфокиназа (К.Ф. 2.7.3.2). Фермент обратимо катализирует фосфорилирование креатина при помощи АТФ:

Креатин + АТФ ↔ Креатин-фосфат + АДФ

Равновесие смещено в сторону обратной реакции, оптимум рН которой 6,8, а скорость прямой реакции максимальна при рН 9,0. Ионы магния, марганца и кальция двухвалентных активируют, а цинка, меди, ртути

иряд тиоловых соединений – ингибируют. Восстановители сульфгидрильных групп – глутатион, дитиотрептол, цистеин – активизируют креатинфосфокиназу (КФК). Фермент содержит в активном центре две тиоловые группы, участвующие в катализе.

Наиболее богаты КФК скелетная мускулатура, значительное количество обнаруживается в кардиомиоцитах, мозге, щитовидной железе, ткани легких. В эритроцитах активности не обнаруживается.

Креатинфосфокиназная реакция регулирует пул аденозинфосфатов. Избыток образованной АТФ активирует передачу макроэргической связи на креатин. Креатинфосфат более стабильное соединение, чем АТФ, и позволяет сохранить энергию для нужд клетки.

КФК отличается множественностью форм – изоформы, конформеры, аллозимы (атипические, патологические формы), наличием макромолекулярных комплексов. Изоферменты представлены цитоплазматическими

иодним митохондриальным изоферментами. Цитоплазматические изоферменты представлены 3 видами: ММ; МВ и ВВ-изоферментами. Все три формы способны к обмену субъединицами. Митохондриальный изофермент также состоит из двух субъединиц, отличных как от М, так и от В-субъединицы.

Вмышцах (скелетной мускулатуре) в основном содержится цитозольный изофермент ММ, а в мозге – ВВ. Изоферментный спектр более сложен в кардиомиоцитах: 1/3 активности КФК представлена митохондриальным изоферментом, 1/3 цитозольным ММ изоферментом и 1/3 цитозольным МВ изоферментом. Конформеры присущи ВВ изоферменту, они представляют собой его структурные варианты. Макромолекулярные комплексы разнообразны: (1) высокомолекулярные комплексы ВВ с гаммаглобулинами G и A; (2) высокомолекулярные агрегаты митохондриального изофермента с белками внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий, где он структурирован; (3) комплексы ММ-изоформы с липопротеидами и некоторыми другими белками; (4) полимеры, образованные не-

69

сколькими молекулами КФК. Атипичные формы КФК по некоторым данным [15] – гликозилированные молекулы фермента.

Активность и изоферментный спектр КФК – прекрасный тест на морфологическое и функциональное состояние различных клеток и тканей организма. В эмбриогенезе изменение активности идет параллельно с дифференциацией тканей. При формировании мышечного волокна возрастает активность КФК за счет замены ВВ изофермента на ММ изофермент. При мышечной дистрофии происходит возврат к ВВ типу.

Креатинфосфокиназа – в основном конститутивный фермент, но может индуктивно синтезироваться под действием инсулина, тироксина, эстрадиола, креатина. Четкая локализация КФК и ее изоферментов определила высокую значимость для использования с целью диагностики, прогнозирования, регистрации тяжести течения заболевания.

Увеличение активности КФК в плазме крови регистрируется при инфаркте миокарда и служит наиболее специфическим тестом при постановке диагноза даже при отсутствии характерных изменений ЭКГ. По изоферментному спектру можно рассчитать и зону некроза. Сроки нормализации, а также рецидивные повышения активности – незаменимые показатели для терапевта при разработке тактики лечения. Определение КФК-ной активности и изоферментного спектра весьма информативны также при прогрессирующей мышечной дистрофии и полимиозитах. Повышение активности регистрируется у практически здоровых людей при сверхвысоких физических нагрузках и является неблагоприятным признаком.

Определение активности. Один из методов основан на реакции креатинфосфата и АДФ, образующийся при этом креатин реагирует с α-нафтолом, диацетил служит катализатором этого взаимодействия (метод Коровкина), интенсивность розового окрашивания измеряется фотометрически. Унифицированный метод основан на сопряженных реакциях и требует присутствия в инкубационной среде двух ферментов:

КФК Креатин-фосфат + АДФ ↔ Креатин + АТФ

АТФ + Глюкоза → Глюкозо-6-фосфат + АДФ Гексокиназа

Глюкозо-6-фосфат + НАДФ → 6-Фосфоглюколактон + НАДФН + Н+ Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

Активность регистрируется по изменению оптической плотности на длине волны 340 нм (тест Варбурга). Протеканию этих реакций мешает аденилаткиназа, катализирующая реакцию:

2АДФ ↔ АТФ + АМФ Аденилаткиназа

70