Материал: Кленова Н.А. Биохимия патологических состояний

В смесь вводится АМФ, который служит ингибитором аденилаткиназы. Хотя эритроциты не содержат КФК, но в них содержится аденилаткиназа, поэтому гемолиз нежелателен.

Аденилаткиназа (К.Ф. 2.4.4.3). Фермент имеет малую молекулярную массу – около 21 кДа и электрофоретически гомогенен. Катализируемая реакция указана выше. Содержится практически во всех клетках (изначально обнаружена в миоцитах). В нормальной плазме активность фермента весьма значительна из-за присутствия тромбоцитов. Клинического значения не имеет, но имитирует активность КФК в нормальной плазме, о чем следует помнить.

В. Гидролазы

Липаза (К.Ф. 3.1.1.3). Фермент ведет себя как эстераза, гидролизуя жиры большой молекулярной массы. Особенно активна липаза по отношению к эфирам жирных кислот. Оптимум рН варьирует в пределах от 7,0 до 9,0. В кислой среде фермент разрушается.

Наиболее важен с клинической точки зрения фермент поджелудочной железы, хотя в клетках различных тканей встречается ряд других липаз. Некоторые из них высоко специфичны: фосфолипаза А, С и другие.

Панкреатическая липаза – водорастворимый фермент и ее действие проявляется только с поверхности жировых капель. Поэтому эффективность действия липазы зависит от степени эмульгирования жиров. Это осуществляется с помощью желчных кислот, гликохолата и таурехолата натрия. Панкреатическая липаза разрушает эфирные связи в α-положении более легко, чем в β-положении. Ингибируется продуктами реакции – жирными кислотами. Активация катионами кальция связана с образованием нерастворимых кальциевых солей жирных кислот и подавлением их ингибирующего действия. Гемоглобин ингибирует липазу, поэтому при определении активности в плазме крови следует избегать гемолиза.

Липаза постоянно поступает в плазму из поджелудочной железы, в норме наблюдаются значительные уровни активности.

Клиническое применение. Повышение активности липазы регистрируется при остром панкреатите, карциноме поджелудочной железы, остром гепатите, острых и хронических заболеваниях почек.

Щелочная фосфатаза (К.Ф. 3.1.3.1). Это целая группа ферментов, неспецифически гидролизующих в щелочных условиях ряд ортофосфорных эфиров. Действуют они либо как гидролазы, либо как фосфотрансферазы:

R – O – PO32– + H2O → R + H3PO4

Гидролаза

R1 – O – PO32– + R2-OH → R1-OH + R2 – PO32–

71

Акцептором фосфата могут стать сахара. Максимальная активность при рН 9,0-10,0. Щелочная фосфатаза широко распространена в тканях человека: особенно много ферментов обнаруживается в слизистой кишечника, остеобластах, плаценте, печени. Они расположены на клеточной мембране, принимают участие в транспорте фосфата. Нативный фермент является димером. Гетерогенен, разнообразие форм связано с локализацией фермента в различных тканях: печеночные, костные, кишечные изоферментные формы.

В сыворотке в норме источником фермента, видимо, являются гепатоциты. Естественные субстраты для данной группы ферментов пока не обнаружены. Для определения активности используется 12 субстратов, наиболее часто – β-глицерофосфат, п-нитрофенилфосфат, фенилфталеинмонофосфат. Щелочные фосфатазы способны гидролизовать и пирофосфат, поэтому в физиологических значениях рН могут действовать как пирофосфатазы.

Основными активаторами щелочной фосфатазы служат ионы Mg2+,

внезначительной степени – Mn2+, Ca2+. При определении в сыворотке крови ионы магния дополнительно не вводят, так как они содержатся в ней

вдостаточном количестве. Ингибиторы щелочной фосфатазы: ЭДТА (связывает ионы магния и кальция), ионы цинка, меди, ртути (двухвалентных), что предполагает наличие в активном центре функциональных SH-групп. Фермент ингибируется также избытком фосфата, желчными кислотами, некоторыми аминокислотами, особенно L-фенилаланином. Ингибирование мочевиной носит сложный характер. Практически все щелочные фосфатазы ингибируются обратимо и неконкурентно, но существует также необратимое ингибирование в зависимости от температуры и рН среды. Это имеет значение при определении источника фермента в плазме. Необратимо и полностью ингибируется изофермент из костной ткани, а печеночный изофермент – частично. Щелочные фосфатазы различаются также по устойчивости к действию низких рН и высоких температур. Щелочная фосфатаза (ЩФ) из костной ткани практически полностью ингибируется при инкубации в течение 20 минут в среде с рН 3,5, тогда как печеночный и ки-

шечный изоферменты сохраняют свою активность соответственно на 50 и 100%. Щелочную фосфатазу из гепатоцитов можно осадить из сыворотки 20% этанолом, тогда как другие формы не осаждаются. Изоформы отличаются также по действию высоких температур. Наиболее устойчив плацентарный изофермент, ЩФ из костной ткани инактивируется при 560С, гепатоцитов – при 610С, слизистой кишечника – при 700С.

Щелочные фосфатазы обнаруживаются и в других биологических субстанциях кроме сыворотки: моче, кале, желчи, слюне, молоке, лимфе.

Определение активности. Измеряется по скорости гидролиза субстратов. Для каждого субстрата подбираются оптимальные условия катализа, особенно рН. Дляβ-глицерофосфатаоптимум– 9,4; дляп-нитрофенилфосфата – 9,8.

72

Если в качестве субстрата используется п-нитрофенилфосфат, то в щелочной среде образуется нитрофенол, имеющий желтую окраску, интенсивность которой измеряется фотометрически. Данный метод имеет преимущественное значение, так как позволяет изучать кинетику реакции. Недостаток – изофермент из слизистой кишечника плохо гидролизует п-нитрофенилфосфат.

Клиническое значение. Увеличение активности происходит при заболеваниях костной системы: рахитах, болезни Педжета (деформирующее воспаление костей), остеогенной саркоме; при заболеваниях печени: механической желтухе (наиболее чувствительный тест для регистрации закупорки желчевыводящих путей). Вирусный гепатит – норма. Исследование изоферментов имеет существенное значение для диагностики злокачественных опухолей, определения локализации метастазов. Снижение активности в лейкоцитах регистрируется при болезни Дауна, лейкемии.

Кислая фосфатаза (К.Ф. 3.1.3.2). Наибольшее содержание данного фермента обнаруживается в предстательной железе, где активность в 1000 раз выше, чем в печени, селезенке, почках, костной ткани. Активность в нормальной плазме появляется после достижения половой зрелости. Оптимум рН составляет 5,0. Кислая фосфатаза относительно нестабильна при рН, превышающих 7,0. Эритроциты, лейкоциты, тромбоциты содержат значительное количество кислой фосфатазы (КФ), поэтому при хранении образца результаты искажаются за счет выхода фермента из форменных элементов, тогда как активность других изоферментов падает. Изофермент из клеток крови более устойчив к действию высоких рН. Если образцы необходимо хранить, то рекомендуется сразу отделить сыворотку от форменных элементов и закислить до рН 5,0-6,0.

Электрофорез определяет от 4-х до 14-ти полос активности КФ. Для определения источника фермента целесообразно использовать избирательное ингибирование. В клетках кислая фосфатаза локализована в основном в лизосомах. Эритроцитарный изофермент полностью можно ингибировать формальдегидом, а изоформу из предстательной железы – L-тартратом.

Определение активности. Используются те же субстраты, что и для определения ЩФ. В качестве буферов применяется ацетатный или цитратный со значением рН от 4,9 до 5,6. Об активности судят по накоплению фенола, если субстрат фенилфосфат, или по накоплению фосфата, если субстрат β-глицерофосфат.

Клиническое применение. В основном применяется для ранней диагностики и наблюдения за ходом лечения карциномы предстательной железы. Повышение активности регистрируется также при карциноме молочной железы и лимфобластной лейкемии.

5΄-Нуклеотидаза (К.Ф. 3.1.3.5). Фермент является фосфомоноэстеразой, специфически гидролизирующей нуклеозид-5΄-фосфаты. Типичными

73

субстратами являются аденозин-5΄-фосфат и инозил-5΄-фосфат. Сложность состоит в том, что те же субстраты гидролизует и щелочная фосфатаза.

Фермент активируется ионами магния и ингибируется ионами никеля. Есть практически во всех клетках, локализован в мембранах. Наибольшее количество обнаруживается в гепатоцитах, лейкоцитах, эритроцитах.

Клиническое значение. Фермент служит маркером структурной деградации фосфолипидного слоя мембран, так как его активность зависит от микроокружения. Кроме того, он одним из первых выходит из поврежденной мембраны. Часто используется для оценки функционального состояния печени при других заболеваниях, прямо не касающихся данного органа (инфаркт миокарда, инсульт), обнаружения метастазирования опухолей в печень. В лейкоцитах фермент определяет функциональную активность по производству активных форм кислорода («респираторный взрыв»), так как непосредственно связан с обменом аденозина, выполняющего регуляторную роль в нейтрофилах.

Определение активности. В качестве субстрата используют АМФ, ЩФ ингибируется добавлением ЭДТА, фермент активируется ионами магния. Активность определяют по количеству освобожденного фосфата за единицу времени.

α-Амилаза (К.Ф. 3.2.1.1). Открыта в 1833 г., гидролизует α-1,4-гликозидную связь в амилозе. Представляет собой эндогликозидгидролазу, для проявления активности необходимо присутствие хотя бы трех α-1,4-гликозидных связей. Конечные продукты гидролиза амилозы – мальтоза и мальтотриоза; крахмала – мальтоза, мальтотриоза, изомальтоза. Две связи на нередуцирующем конце и одна связь на редуцирующем конце устойчивы к действию амилазы.

Методы определения. Принцип определения основан на реакции крахмала с йодом. Обычно используется фосфатный буфер с рН 7,2, 0,24% раствор крахмала и 30-минутная инкубация при 370С. Затем количество оставшегося крахмала определяется по реакции с йодом. Интенсивность синего окрашивания измеряется фотометрически.

Фермент имеет малую молекулярную массу (48 кДа), это приводит к тому, что фермент легко фильтруется почечными клетками и появляется

вмоче. Основными источниками α-амилазы у человека являются соки поджелудочной и слюнных желез, незначительная активность обнаруживается

вдругих тканях. Активность амилазы значительно возрастает в присутст-

вии NaCl, оптимум рН колеблется от 6,5 до 7,5 в зависимости от индивидуальных особенностей фермента. Амилаза содержит 1 грамм-атом Са2+на 1 молекулу и ингибируется в присутствии ЭДТА, оксалоацетата, цитрата.

Ферменты из поджелудочной и слюнных желез не имеют существенных отличий, не различаются иммунохимически и почти идентичны по электрофоретической подвижности (располагается в области γ-глобулинов.

74

Клиническое применение. Повышение активности фиксируется при остром панкреатите (в 10-50 от нормы). Резко увеличивается также содержание фермента в моче. Тест применяется для дифференциальной диагностики приступа острого холецистита (нет повышения активности) и панкреатита, так как клинические симптомы схожи.

Интересным является факт обнаружения значительной активности в сыворотке крови некоторых людей, не страдающих панкреатитом, причем активность в моче остается в пределах нормы. Это явление получило название «макроамилаземия» и объясняется склонностью амилазы данных людей к образованию макромолекулярных комплексов с γ-глобулинами, которые не фильтруются почками.

β-Глюкуронидаза (К.Ф. 3.2.1.31). Фермент гидролизует большое количество алифатических и ароматических эфиров β-D-глюкуроновой и определенных эфиров β-галактуроновой кислот. β-Глюкуронидаза (β-ГУ) встречается практически во всех тканях, но особенно много ее в печени, где она распределена в различных субклеточных частицах.

β-ГУ проявляет свою активность при относительно низких значениях рН, имеет три оптимума рН для трех различных изоформ: 3,8; 4,5 и 5,2. Фермент специфически ингибируется сахарозо-1,4-лактином и инактивируется ионами тяжелых металлов.

Определение активности. Субстратами служат различные фенольные глюкурониды. Обычно после инкубации определяют фенол с реактивом Фолина-Чекалтэу. Если в качестве субстрата используется фенолфталеинглюкуронид, то применяется глициновый буфер с рН 10,4 и измеряют интенсивность розового окрашивания (λ550 нм). Следует помнить, что активность фермента в щелочной среде достаточно низка.

Клиническое применение. Основные заболевания, при которых отмечается повышение активности β-ГУ, – злокачественные заболевания и болезни печени. Активность β-ГУ прогрессивно нарастает во время беремен-

с N-концевыми остатками фенилаланина, триптофана, гистидина или тирозина.

Лейцинаминопептидаза широко распространена в тканях человека, причем наиболее богатые источники ее тонкий кишечник, почки и печень. Молекулярная масса фермента 80 кДа, он активируется ионами кальция, марганца и магния в зависимости от используемого субстрата и тканевого источника фермента. Ингибируют лейцинаминопептидазу цианиды и ЭДТА. Обнаружено существование множественных форм фермента в сыворотке крови человека, которые представляют собой изоферменты из пече-

75