Материал: Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Иммунофлюоресценция в клинике аутоиммунных буллезных дерматозов

Махнева Н.В., Белецкая Л.В.

Иммунофлюоресценция в клинике аутоиммунных буллезных дерматозов.

Москва 2010

Издательство "Академия Естествознания", 2010 год

ISBN 978-5-91327-103-7

В настоящем пособии описаны методы современной диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов – прямой и непрямой методы иммунофлюоресценции. Эти методы в сопоставлении с клиникоморфологическими данными значительно расширяют возможности диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов. Пособие рассчитано на врачей-дерматологов, иммуноморфологов, а также врачей разных специальностей, в практике которых встречаются больные, страдающие аутоиммунными буллезными дерматозами.

Содержание:

Введение

Основные принципы использования методов иммунофлюоресценции

Прямой метод иммунофлюоресценции Непрямой метод иммунофлюоресценции Аутоиммунная пузырчатка Буллезный пемфигоид

Приобретенный буллезный эпидермолиз Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз Герпетиформный дерматит Дюринга Заключение Список литературы

Введение

Одной из наиболее актуальных проблем в клинике пузырных кожных заболеваний является установление точного диагноза с целью дифференциальной диагностики и подбора адекватных методов терапии, т.к. разные формы патологии требуют различные схемы лечения. Существующие данные по результатам применения некоторых лабораторных методов в дополнение к клиническому обследованию свидетельствуют о том, что во многих случаях они помогают уточнению диагноза.

Включение иммунофлюоресценции в арсенал методов исследования в патологии и, в частности, иммунопатологии способствует выяснению многих сторон патогенеза целого ряда заболеваний человека. Применение ее классических вариантов (прямая и непрямая иммунофлюоресценция) наряду с другими способами исследования (морфологический, гистохимический, биохимический)позволяет всесторонне изучить патологический процесс, происходящий в любом органе и тканях, в том числе и в коже. Так, с помощью классических методов иммунофлюоресценции удается выявить фиксированные иммунные комплексы (иммуноглобулины и компоненты комплемента) в видимо непораженной коже больного и наличие в сыворотке больных циркулирующих аутоантител, направленных к антигенам тканей кожи. Более 40 лет назад появление этих методов явилось технологической революцией в диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов, таких как истинная пузырчатка, буллезный пемфигоид, герпетиформный дерматит Дюринга. Позднее, разработка метода расщепления базальной мембраны эпидермиса и применение классических методов иммунофлюоресценции позволили точно определить локализацию патологического процесса аутоиммунных буллезных дерматозов с поражением дермоэпидермального соединения, таких как буллезный пемфигоид, приобретенный буллезный эпидермолиз, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и провести между ними дифференциальную диагностику. Кроме того, синтез двух этих методов позволил определить локализацию антигенов мишеней in situ для фиксированных иммунных комплексов и аутоантител, циркулирующих в сыворотке крови больных линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом, и отдифференцировать этот буллезный дерматоз от герпетиформного дерматита Дюринга.

Итак, методы иммунофлюоресценции, используемые в клинике кожных болезней, в частности аутоиммунных буллезных дерматозов, остаются в настоящее время единственным иммунопатологическим инструментом необходимым в диагностике пузырных дерматозов.

Основные принципы использования методов иммунофлюоресценции В 40-х годах ХХ века Coons был предложен оригинальный принцип

люминесцентной микроскопии - метод иммунофлюоресценции, сущность которого заключается в использовании люминесцентного варианта реакции антиген - антитело, происходящей при соединении антигенов с соответствующими специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями.

Метод люминесцирующих антител для выявления антигенов и антител применяется в двух модификациях: прямой и непрямой методы. Иммунологическая реакция между антигеном и антителом происходит непосредственно на предметном стекле.

Прямой метод иммунофлюоресценции

Связанные с тканями иммуноглобулины определяют классическим способом прямой иммунофлюоресценции, который осуществляется следующим образом. При взятии биопсии с целью изучения связанного с тканями иммуноглобулина из пораженных или клинически здоровых участков кожи или слизистой оболочки вырезают небольшие кусочки размером 5х5 мм. Ткань биоптата замораживают при низкой температуре (минус 20-60°С). Серийные срезы из замороженной нефиксированной ткани толщиной 5 мкм готовят в криостате (минус 20°С), помещают на предметное стекло, подсушивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) pH 7,0-7,4 в течение 10 мин с целью удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывают люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против иммуноглобулинов основных классов (G, A, M), С3 компонента комплемента и фибрина в течение 30 мин. Затем вновь промывают PBS в течение 10 мин и заключают под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. С целью предохранения срезов от выгорания в люминесцентном микроскопе в глицерин добавляют пара-фенилендиамин. Для контроля одновременно проводят изучение криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, в световом микроскопе.

Связанные с тканями иммуноглобулины и иммунные комплексы, определяемые прямым методом иммунофлюоресценции, обнаруживаются как в участках пораженной кожи, так и в отдаленных ее участках, что свидетельствует о распространенности процесса. Однако необходимо отметить, что в участках с наличием видимых нарушений структуры кожи или слизистой оболочки, т.е. в эпицентре поражений нередко обнаруживают лишь следы фиксированного иммуноглобулина. Это является весомым аргументом для использования биоптатов тканей только клинически непораженной кожи - как удаленных, так и из соседних с поражением участков. Кроме того, с учетом системного поражения и способности кожи элиминировать иммунные комплексы из организма, в случаях локального поражения только в слизистых оболочках полости рта, носа или гениталий, т.е. в местах недоступных для взятия биопсии, могут быть использованы здоровые на вид участки кожи больных. Таким путем удается выявить наличие у больного синдрома иммунных комплексов.

Непрямой метод иммунофлюоресценции

Циркулирующие аутоантитела в сыворотке крови больных выявляют с помощью непрямого метода иммунофлюоресценции, используя различные субстраты из тканей кожи и других органов человека и ряда видов лабораторных животных (крысы, мыши, кролика, обезьяны), т.к. аутоантитела при аутоиммунных буллезных дерматозах направлены к тканеспецифическим антигенам, имеющимся в органах большинства видов животных класса млекопитающих. При этом различия реакций в титрах на срезах тканей разных видов животных с сыворотками одного и того же больного носит лишь количественный характер. Наиболее чувствительным субстратом по нашим данным являются пищевод кролика, кожа кролика и крысы, слизистая оболочка полости рта крысы; наименее чувствительными - нормальная кожи человека и обезьяны, пищевод обезьяны и нечувствительными - слизистая оболочка полости рта и влагалище обезьяны. Криостатные нефиксированные срезы толщиной 4-5 мкм тщательно промывают в PBS (pH 7,0-7,4) в течение 10 мин, затем срезы сначала обрабатывают