Материал: методичка рб

лигатуры, весь желудочно-кишечный тракт вынимают целиком. Внутренние органы при повышенном содержании в них радионуклидов вывозят на захоронение, как радиоактивные отходы. Шкуру консервируют мокросолёным способом. После работы производят дезактивацию помещений, оборудования и персонала с последующим радиометрическим контролем.

При внешнем облучении животных проводят послеубойный осмотр туши. При обнаружении патологоанатомических признаков лучевой болезни пробы тканей следует направить на бактериологическое исследование. Мясо, попавшее под нейтронное или γ-облучение, следует выдержать в морозильной камере в течение не менее чем 5 дней для исчезновения наведённой радиоактивности.

При внутреннем облученииубивать животных следует не ранее, чем через 7 – 10 дней после окончания поступления радионуклидов в их организм. Проводят послеубойный осмотр, как указано выше, а также радиометрию туши и органов. Радиометрию предпочтительно проводить переносным спектрометром «Сигнал-М» в исполнении «Таможенник» или ДРГБ-01. Он показывает содержание цезия в мясе. При его отсутствии проводят γ-радиометрию и по её данным все туши подразделяются на группы с таким расчётом, чтобы в каждой группе мощность дозы различалась не более, чем в два раза. От каждой группы отбирается средняя проба мяса и направляется в лабораторию на спектрометрию. При повышенном содержании в тушах радионуклидов лимфоузлы и щитовидная железа конфискуются.

Санитарная оценка мяса. Без ограничений мясо выпускается, если нет патологических изменений.радиоактивность не повышена. Допускаются внешние загрязнения кожи радионуклидами. Если содержание радионуклидов в мясе повышено не более чем в 10 раз против предельно допустимого уровня, мясо направляется на промышленную переработку, а субпродукты – на техническую утилизацию.Если содержание радионуклидов в мясе повышено более чем в 10 раз против предельно допустимого уровня, мясо направляется на техническую утилизацию, а субпродукты – на захоронение. Приобнаружении в мясе кокков, кишечной палочки.протея или возбудителей паратифа оно направляется на промышленную переработку.

Молоко от животных с лучевой болезнью в скрытый период выпускается без ограничений. В первый месяц при появлении симптомов лёгкой и средней степени болезни молоко следует использовать после 30-минутного кипячения. При внутреннем радиоактивном заражении животных молоко следует направлять: на промышленную переработку. Если обнаружится бактериальная обсеменённость молока, то его надлежит использовать согласно соответствующим инструкциям.

Способы обезвреживания продуктов с повышенным содержанием радионуклидов. Для мяса: обвалка; проварка в течение 3 часов в кусках массой не более 800 г и толщиной не более 8 см; переработка на варёную колбасу с проваркой батонов в кипятке; при этом допускается также разбавление «чистым» мясом с тем, чтобы окончательное содержание радионуклидов в продуктах не превышало предельно допустимого уровня. Для молока: переработка на топлёное масло; менее желательно – на творог кислотным способом или очистка с применением ионообменных смол.

Вопросы к занятию:

1.Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса при лучевых поражениях.

2.Ветеринарно-санитарная экспертиза молока от животных с лучевыми поражениями.

3.Способы обезвреживания продуктов с повышенным содержанием радионуклидов.

Занятие17.Радиоиммунный анализ гормонов в плазме крови животных – 2 часа.

Цель занятия: изучить принцип радиоиммунного анализа на примере определения инсулина в плазме крови.

Инсулин - полипептидный гормон с молекулярной массой около 6000, который образуется в β-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы из своего предшественника - проинсулина. Молекула гормона состоит из двух цепей: короткая цепь А содержит 21 остаток аминокислот, а более длинная цепь В - 30 остатков. Сравнительный анализ гормонов, полу-

ченных от животных разных видов и человека, показал незначительные отличия в аминокислотной последовательности этих молекул в 8...10-й позиции цепи А и 30-м положении цепи В. Несмотря на это активность инсулина из поджелудочных желез разных животных приблизительно одинаковая. Предполагают также, что для связывания инсулина клеточными рецепторами специфическое значение имеют аминокислоты в 24...29-м положении цепи В, которые одинаковы у всех млекопитающих животных, в частности у крупного рогатого скота и человека. Это позволяет использовать тест-наборы, предназначенные для определения уровня инсулина у человека, для исследования его у животных.

Из поджелудочной железы инсулин поступает в кровь непрерывно, период его полураспада в периферической крови составляет 8...10 мин. В плазме часть инсулина связывается с белком (связанный инсулин), а часть (свободный инсулин) быстро переходит в ткани - скелетные мышцы, печень, почки, где реализуется действие и происходит инактивация гормона вследствие расщепления его молекул протеолитическими ферментами. Часть инсулина выводится из организма с мочой.

Основная функция инсулина в организме - регуляция уровня глюкозы в крови. Инсулин стимулирует переход глюкозы из крови в ткани. В свою очередь, секреция инсулина по принципу отрицательной обратной связи регулируется уровнем глюкозы в циркулирующей крови: глюкоза вызывает быстрое, в течение 3...5 мин, высвобождение инсулина из панкреатических β-клеток. Кроме того, инсулин влияет на транспорт ионов калия и аминокислот через мембраны, а также воздействует через белковый и жировой обмены на общий метаболизм.

Принцип определения инсулина радиоиммунологическим методом общий. Поскольку из всех форм инсулина только свободный инсулин хорошо реагирует с антителами, полученными к кристаллическому гормону, при помощи наборов определяют концентрацию свободного (иммунореактивного) инсулина в сыворотке крови животных. Отечественные наборы «Рио-инс-ПГ-1251», предназначенные для анализа гормона в сыворотке крови человека, вполне применимы для определения инсулина у животных, так как антисыворотка, используемая в этих наборах, имеет 100%-ную перекрестную реакцию с инсулином свиньи и крупного рогатого скота. Набор рассчитан на проведение 100 определений (44 пробы неизвестного образца и 6 проб для построения калибровочной кривой), выполняемых в дубликатах.

Материалы и оборудование: полуавтоматические пипетки на 100 и 800 мкл со сменными наконечниками, стеклянные пипетки на 1 и 10 мл, аппарат для встряхивания пробирок, холодильник низкотемпературный, центрифуга рефрижераторная, гамма-счетчик, дистиллированная вода, резиновые перчатки, тест-набор «Рио-инс-ПГ-1251».

Всостав набора входят: 1251-инсулин активностью 30...74 кБк в лиофилизированной форме, 6 калибровочных проб, содержащих 0, 10, 25, 50, 100 и 200 мкед/мл инсулина, буферный раствор с рН 7,4 12 мл, антисыворотка к инсулину, полученная иммунизацией морских свинок, раствор полиэтиленгликоля.

Приготовление реагентов: все реагенты при приготовлении необходимо перемешивать, избегая потерь на крышках флаконов и пенообразования.

Во флакон с 1251-инсулином приливают 11 мл дистиллированной воды.

Каждую калибровочную пробу растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды, оставляют флаконы на 10 мин при комнатной температуре для растворения таблетки, аккуратно перемешивают.

Во флакон с препаратом антисыворотки приливают 11 мл дистиллированной воды. Буферный раствор и раствор полиэтиленгликоля поставляют готовыми для анализа. Выполнение работы. Сыворотку крови (плазму) хранят до анализа при температуре - 20

ºС. Не рекомендуется исследовать гемолизированную сыворотку. Для последующего автоматического расчета концентрации гормона ставят пробы на неспецифическое связывание (Н)и общую активность (Т).

Впробирки Тдобавляют микропипеткой 0,3 мл буфера, в пробирки Н- 0,2, а в остальные - по 0,1 мл в дубликатах.

Во все пробирки вносят по 0,1 мл меченого реагента.

Добавляют по 0,1 мл стандартов (от меньшей концентрации к большей) или исследуемой сыворотки.

Во всё пробирки (кроме Т и Н)приливают по 0,1 мл антисыворотки.

Содержимое всех пробирок тщательно перемешивают на шейкере и инкубируют в течение 3 ч (возможно 18 ч) при 2...8 ºС. При повторных анализах рекомендуется выдерживать одно и то же время инкубации для лучшей сравнимости результатов.

После инкубации в каждую пробирку (кроме 7) добавляют по 0,8 мл (800 мкл) раствора полиэтиленгликоля для разделения свободной и связанной фракций лиганда. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают на смесителе в течение 5...8 мин для получения равномерной суспензии белков.

Все пробирки (кроме 7) одновременно центрифугируют 20 мин при 1500...2000 g и 2...8 ºС. После центрифугирования из всех пробирок сливают надосадочный раствор. Для удаления остатков жидкости их оставляют перевернутыми на фильтровальной бумаге в вытяжном шкафу на 10... 15 мин. Затем все пробирки с осадками и пробирки Т помещают на гамма-счет-

чик и измеряют скорость счета в каждой из них за 1 мин.

При использовании счетчиков фирмы ЛКБ концентрация гормона рассчитывается автоматически. Для перевода объемно-весовой концентрации инсулина в молярную рекомендуется пользоваться следующим соотношением: 1 мкед инсулина = 37,3 пг; 1 пг/мл • 0,172 = 1 пмоль/л инсулина.

Коэффициент вариации при проведении анализа одним набором в одно и то же время не превышает 10 %. Чувствительность определения 2...3 мкед/мл. Процент открытия инсулина, добавленного в образцы сыворотки крови, составляет 90...110.

Вопросы к занятию:

1.Принцип радиоиммунного анализа.

2.Методика радииммунного анализа гормонов.

Литература Основная:

1.Лысенко, Н. П. Радиобиология [Текст] / Н. П. Лысенко, В. В. Пак, Л. В. Рогожина, З. Г. Кусурова. – М., С.-Пб., Краснодар: Лань, 2012. – 570 с.

2.Лысенко, Н. П. Радиобиология [Электронный ресурс] / Н. П. Лысенко, В. В. Пак, Л. В. Рогожина, З. Г. Кусурова. – М., С.-Пб., Краснодар: Лань, 2012. – 570 с. – ЭБС «Лань». – Ре-

жим доступа: http://e.lanbook.com.

Дополнительная:

1. Лысенко, Н. П. Практикум по радиобиологии [Текст] / Н. П. Лысенко, В. В. Пак, Л. В. Рогожина, З. Г. Кусурова, С. В. Тимофеев. – М., С.-Пб., Краснодар: Лань, 2007. – 400 с.

Информационные ресурсы:

1. Издательство «Лань» - режим доступа: http://e.lanbook.ru

2. Электронная библиотека РГАТУ - режим доступа: http://bibl.rgatu.ru/web

Оборудование