Явления гиперкератоза при диагнозе «Плоский лишай» на слизистой оболочке щек, потенциально способных к малигнизации, рассматривались нами на предмет замедления или отсутствия процессов апоптоза. Морфология клеток эпителия этого участка принципиально отличалась от морфологии клеток эпителия сосочков языка с неповрежденной поверхности. Эпителиальные клетки имели звёзчатую форму, чёткие края и были истончены. Все клетки сохранили ядра. В центре очага было выявлено отсутствие каспазной активности в эпителии, т.е. наблюдалось отсутствие или замедление процессов запрограмированной смерти клеток.
На границе очага гиперкератоза была выявлена промежуточная активация терминальных каспаз при ороговении клеток в очаге гиперкератоза. Данная активация протеаз носила локализованный характер и не была связана с фрагментацией клетки, экспрессией сигналов смерти и фагоцитозом умершей клетки. Возможно, развитие окраски связано с активацией других некаспазных протеаз, которые, однако, действуют по такому же протеолитическому механизму. Процессы все же отличаются от апоптоза и требуют дальнейшего изучения.
Т.о., нами зарегистрирован факт замедления и отсутствия явлений апоптоза в центре очага гиперкератоза и промежуточной активации терминальных каспаз на периферии очага, функция которых отличается от функции при апоптозе.
Как уже было отмечено ранее, язык находится на границе ротовой полости и эзофагогастродоуденального отдела. Он первым встречает воздействия стрессорных факторов, обусловленных патологическими процессами в этих отделах. Поверхность корня языка является местом обитания большого количества микрофлоры и первичным звеном полости рта, которое испытывает кислотный стресс при попадании на нее рефлюксного содержимого и изменении рН ротовой жидкости. Согласно многочисленным публикациям, патологические изменения, которые возникают в ЖКТ, в первую очередь отражаются на состоянии языка (Банченко Г.В., 2000; Боровский Е.В., Машкиллейсон А.Л., 2001; Гажва С.И., 2001; Гараева А.Г. , 2003; Уразова Р.З., Шамсутдинов Н.Ш., 2001; Corrкa MC, Lerco MM, Henry MA., 2008; Di Fede O и др., 2005). Воздействия стрессорных факторов могут инициировать повреждения эпителиального слоя вплоть до гибели эпителиальных клеток. Появление очагов повышенной десквамации на спинке языка - следствие этих процессов.
Прежде чем сделать попытку разобраться с процессами усиленной десквамации эпителия языка, было решено с помощью сканирующей электронной микроскопии уточнить гистоморфологию нитевидных сосочков, т.к. нитевидные сосочки являются самыми многочисленными. Эти сосочки имеют ороговевающий эпителий, т.е. выполняют защитную функцию. Они имеют тактильные нервные окончания и не имеют вкусовых луковиц.
На электронных фото, сделанных при СЭМ, в норме четко определяются первичные и вторичные нитевидные сосочки (рис.1).
Рис. 1. Микрофото периферийной части нитевидного сосочка языка. Вторичные выросты расположены в ложе основного сосочка. СЭМ. Увеличение х200. (Гусев С.А., Лукина Г.И.)
Вторичные сосочки покрыты пластом микробной флоры. Остальная часть нитевидного сосочка на своей поверхности практически не имеет микробной флоры. Чего нельзя сказать о нитевидных сосочках на участках десквамации. При процессах усиленной десквамации вторичные сосочки утрачиваются вместе с микрофлорой, обитающей на них. Обильная микрофлора при такой ситуации начинает размещаться на поверхности наружных эпителиальных клеток первичного сосочка. Но связь с поверхностью здесь, по всей видимости, не очень прочная (рис.2).
Рис. 2. Микрофото нитевидного сосочка языка на участке усиленной десквамации дорсальной поверхности языка. СЭМ. Увеличение х200. (Гусев С.А., Лукина Г.И.)
Подтверждение этому найдено и при конфокальной микроскопии. Картина на этих участках отличалась от ситуации, зафиксированной при СЭМ. Подготовка препарата при конфокальной микроскопии предусматривает центрифугирование биоптата. На первичном сосочке с утраченными вторичными сосочками микрофлора не обнаруживалась. Предположение о непрочной связи микробной флоры с клетками эпителия в данном случае имеет под собой основание.
Итак, гистоморфологическими исследованиями, выполненными СЭМ и конфокальной микроскопией, подтверждено, что усиленная десквамация поверхности языка характеризуется потерей целого морфологического образования - вторичных сосочков и изменением строения эпителия и функции эпителиальных клеток нитевидных сосочков. Хорошо известно, что такие изменения слизистой, как усиленная десквамация, не являются результатом механического повреждения. Они достаточно быстро развиваются и носят рецидивирующий характер. Более того, изучение регенеративных процессов на микроскопическом уровне выявило быстрое восстановление вторичных сосочков. Все это говорит о том, что, не смотря на значительное повреждение, в эпителии сохраняются прогениторные структуры, ответственные за морфогенез сосочков. Предполагается, что в основе потери вторичных сосочков лежит определённый молекулярный механизм, заданная внутриклеточная программа. Данное предположение основано на ряде известных наблюдений. Во-первых, морфологические перестройки в органах происходят запрограммированно и контролируемо. Во-вторых, органогенез, морфогенез, гомеостаз и репарация тканей регулируются посредством запрограммированного замещения и дифференциации отдельных клеток. В-третьих, удаление ненужных клеток происходит через запрограммированный внутриклеточный механизм смерти. Возможно, что “сбрасывание” вторичных сосочков может выполнять защитную или регенеративную функцию и происходить через апоптоз определённых клеток эпителия. В связи с этим нами было проведено исследование механизмов смерти клеток в норме и при выраженной десквамации.
Следует отметить, что среди известных нам работ по микроскопическим и гистохимическим исследованиям слизистой языка явление потери вторичных сосочков было описано только группой доктора Kullaa-Mikkonen (University of Kuopio, Finland) при исследовании срезов “географического языка” методом сканирующей электронной микроскопии (Kullaa-Mikkonen 1986, Jдrvinen 1991).
Конфокальная микроскопия и проточная цитометрия проведены на анализе 13780 эпителиальных клеток, который дал возможность выявить и подсчитать поврежденные и погибшие клетки на клинически неповрежденных участках поверхности языка и на участках усиленной десквамации. По данным цитометрии количество поврежденных клеток в эпителии нитевидных сосочков на участках усиленной десквамации возрастает с увеличением тяжести заболеваний пищевода, связанных с рефлюксом желудочного содержимого. У пациентов, страдающих гастродуоденитами и язвенной болезнью, количество поврежденных клеток эпителия нитевидных сосочков на неповрежденных участках резко снижается. Число мертвых клеток имеет на этих участках аналогичную тенденцию. Мёртвые клетки практически не выявлены у пациентов VI группы.
Что касается пациентов с заболеваниями органов холецистопанкреатической зоны, то по данным цитометрии количество поврежденных клеток резко возрастает в группе VII. В группе VIII этот показатель оказался низким. Хотя показатель гибели клеток у пациентов в этих группах не имел существенных различий и находился на низком уровне.
При анализе микробной обсемененности поверхности нитевидных сосочков выявлена тенденция увеличения поврежденных клеток при наличии прикрепленной к ним микробной флоры. Количество мертвых клеток не имело резких колебаний и не зависело от уровня контаминации микроорганизмами эпителиальных клеток.
Наиболее распрастранёнными механизмами смерти клеток в ходе воздействия повреждающих факторов являются некроз и апоптоз. Апоптоз имеет ряд ясных морфологических и биохимических особенностей. К классическим морфологическим чертам относится конденсация ядра и его последующая фрагментация. В ходе апоптоза фрагментируется также и сама клетка, сохраняя при этом целостность внешней мембраны (образуются апоптотические везикулы). Апоптоз характеризуется активацией целого ряда специфических нуклеаз и протеаз. Апоптотические протеазы (каспазы), активируются по каскадному механизму. Состав участников этого каскада зависит от инициатора апоптоза и типа клеток. Независимо от этих факторов всегда активируется последняя (терминальная) протеаза каскадной цепочки - каспаза-3. Для определения апоптоза требуется оценка морфологического и биохимического критерия. Мы оценивали целостность плазматической мембраны клеток, фрагментацию ядер и активацию каспазы-3.
Оценивая флуоресцентность эпителиальных клеток, нами выявлено, что ее интенсивность, пропорциональная протеолизу субстрата, различна в разных зонах нитевидных сосочков. Флуоресценции не наблюдалась в основании первичного сосочка, где располагается соединительная ткань. В клетках вторичных сосочков она выявлялась слабо. В многослойном эпителии она была хорошо выражена. Самый яркий сигнал наблюдался в областях, соответствующих луковице, в которых располагались вторичные сосочки, а также в поверхностных и в наиболее глубоких слоях эпителия. В эпителии присутствует и ZVAD-независимая флуоресценция, указывающая на неспецифичный распад проб.
Нами установлено, что СОР при заболеваниях верхних отделов ЖКТ имеет морфофункциональные особенности, что согласуется с данными Silva M.A., Damante J.H. (2001), которые при гистопатологическом исследовании слизистой оболочки неба установили, что ГЭРБ приводит к микроскопическим воспалениям слизистой оболочки мягкого неба. По результатам наших исследований, особенно заметные изменения происходят на поверхности языка.
Язык - орган в полости рта, который одним из первых встречает как внешние, так и внутренние раздражители. А эпителиальные клетки вторичных выростов нитевидных сосочков принимают на себя основную тяжесть повреждающих факторов, появляющихся в полости рта. Механизм повреждения и смерти этих клеток носит иной характер, нежели клеток других участков нитевидного сосочка. Они выдерживают мощное воздействие токсинов, выделяемых микробной флорой и агрессивной среды, поступающей из ниже лежащих отделов ЖКТ при частых и длительных рефлюксах. У части пациентов нарушены механизмы регуляции сбрасывания и регенерации вторичных выростов нитевидных сосочков. При этом очаги десквамации меняют свое местоположение на поверхности языка. У другой части пациентов, имеющих постоянную локализацию очагов повышенной десквамации на языке, изначально заложена гистоморфологическая особенность, проявляющаяся в несовершенном строении вторичных сосочков и нарушении связи между эпителиальными клетками.
Т.о., нашими исследованиями доказано, что состояние слизистой оболочки языка может служить существенным признаком, подтверждающим наличие и тяжесть заболеваний верхних отделов ЖКТ.
Воздействия стрессорных факторов при рефлюксе могут инициировать повреждения эпителиального слоя. По данным цитометрии количество поврежденных клеток в эпителии нитевидных сосочков на участках усиленной десквамации возрастает с увеличением тяжести заболеваний пищевода, связанных с рефлюксом желудочного содержимого. У пациентов, страдающих гастродуоденитами и язвенной болезнью, количество поврежденных и мертвых клеток эпителия нитевидных сосочков на неповрежденных участках резко снижается. Количество поврежденных клеток резко возрастает при заболеваниях желчного пузыря и снижается при заболеваниях поджелудочной железы. Гибель клеток у этих пациентов незначительна и не имеет существенных различий при заболеваниях органов холецистопанкреатической зоны.
Интенсивность флуоресцентности, указывающая на активацию терминальных каспаз, в эпителиальных клетках различна в разных зонах нитевидных сосочков: наиболее яркая - в луковицах, в которых располагались вторичные сосочки; в многослойном эпителии в поверхностных и наиболее глубоких слоях; слабая - в клетках вторичных сосочков и не наблюдалась в соединительной ткани у основания первичного сосочка. В эпителии присутствовала и ZVAD-независимая флуоресценция, указывающая на неспецифичный распад проб.
Нами подтверждено положение о снижении процессов естественной смерти эпителиальных клеток при плоском лишае, что может служить дополнительным дифференцально-диагностическим признаком этого заболевания.
На участках слизистой оболочки щек с проявлениями гиперкератоза при плоском лишае зарегестрированы: замедление и отсутствие процессов апоптоза в центре очага гиперкератоза и промежуточная активации терминальных каспаз на периферии очага, что также должно настораживать клинициста.
Выводы
· На основании клинического обследования пациентов с заболеваниями органов пищеварения установлено: частыми клиническими изменениями слизистой оболочки в полости рта при заболеваниях органов эзофагогастродуоденальной зоны являются: пастозность слизистой оболочки (58,6%), сухость полости рта, губ (43%), обильный налет на языке (50,9%). При заболеваниях органов холецистопанкреатической зоны эти проявления встречаются: пастозность - у 51,2% больных, сухость - у 52,4%, у 61,9% - налет на языке.
· Установлена прямая корелляционная связь pH полости рта и пищевода при различных формах заболевания эзофагогастродуоденальной зоны. Наибольшее снижение рН полости рта 5,2±0,2 наблюдается при гастроэзофагеальной рефлюксной болезни.
· Выявлен рост колоний: фузобактерий в группе с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью (у 83,3% пациентов), лептотрихий - у больных с дисфункцией желчного пузыря и хроническими холециститами (у 88,2%) и неэрозивной рефлюксной болезнью (у 87,5%), грибов Candida - при неэрозивной рефлюксной болезни (у 56,3%) и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (у 50%), энтерококов - у пациентов с хроническими гастритами, язвенной болезнью желудка и 12-перстной кишки (у 40%). Контаминация H.pilory слизистой оболочки языка выявлена только при хронических гастритах и язвенной болезни желудка в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки и желудка в 16,4% случаев, при гастроэзофагеальной болезни - в 15,4%, при дисфункциях желчного пузыря и хроническими холециститами - в 10% случаев.