Транспозоны: Транспозоны представляют собой нуклеотидные последовательности, включающие от 2000 до 20 500 пар нуклеотидов, которые несут генетическую информацию, необходимую для транспозиции. При включении в бактериальную ДНК они вызывают в ней дупликации, а при перемещении -- делеции и инверсии. Транспозоны могут находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы, неспособной к репликации. Она реплицируется только в составе бактериальной хромосомы. При этом новые копии транспозонов могут мигрировать в некоторые плазмиды и ДНК фагов, которые, проникая в бактериальные клетки, способствуют их распространению в популяции. Таким образом, важнейшим свойством транспозонов является их способность к перемещению с одного репликона (хромосомная ДНК) на другой (плазмида) и наоборот. Кроме того, некоторые транспозоны, так же как и плазмиды, выполняют регуляторную и кодирующую функции. В частности, они могут нести информацию для синтеза бактериальных токсинов, а также ферментов разрушающих или модифицирующих антибиотики.
Транспозоны имеют особые концевые структуры нескольких типов, которые являются маркерами, позволяющими отличать их от других фрагментов ДНК. Это позволило обнаружить их не только у бактерий и дрожжей, но и в клетках растений, насекомых, позвоночных животных и человека. При интеграции транспозонов в хромосому клеток животных или человека они приобретают удивительное сходство с провирусами, находящимися в составе их хромосом.
ls-последовательности: Is-последовательности представляют собой транспозируемые элементы, которые также называются «вставки последовательностей оснований». Это фрагменты ДНК длиной 1000 пар нуклеотидов и более. В Is-последовательностях содержится информация, необходимая только для их транспозиции, т.е. перемещения в различные участки ДНК.
Вследствие такого рода перемещений Is-последовательности могут выполнять ряд функций.
1. Координировать взаимодействие транспозонов, плазмид и уме-енных фагов как между собой, так и с хромосомой бактериальной летки и обеспечивать их рекомбинацию.
2. Вызывать инактивацию гена, в которой произошла интеграция ^-последовательности («выключение» гена), либо, будучи встроенными в определенном положении в бактериальную хромосому, служить промотором (участками ДНК, регулирующих экспрессию подлежащих структурных генов бактерий-реципиентов), который включает или выключает транскрипцию соответствующих генов, выполняя регуляторную функцию.
3. Индуцировать мутации типа делеций или инверсий при перемещении и дупликации в 5-9 парах нуклеотидов при включении в бактериальную хромосому.
В свободном состоянии Is-последовательности не обнаружены, что свидетельствует об их неспособности реплицироваться самостоятельно.
Умеренные и дефектные фаги: Факторами изменчивости бактерий могут быть умеренные или дефектные фаги, которые напоминают по своим свойствам плазмиды бактерий. Встраиваясь в хромосому, эти фаги вызывают ли-зогенизацию бактерий, которые могут приобретать новые признаки.
Изменчивость лизогенных бактерий связана либо с приобретением генов, переносимых данными фагами от их предыдущих хозяев (бактерий-доноров), либо с экспрессией «молчащих» генов бактерий-реципиентов. В последнем случае фаговая ДНК, встраиваясь вблизи поврежденного промотора, заменяет его. При этом синтезируются определенные продукты, например протоксины дифтерийных бактерий, рада клостридий и др.).
24. Виды изменчивости бактерий. Фенотипическая и генотипическая изменчивость. Понятие о популяционной изменчивости
Фенотипические изменения какого-либо признака или нескольких признаков микроорганизма называют модификациями. В отличие от мутаций они, хотя и находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре утрачиваются.
Модификации возникают как адаптивные реакции отдельных микробных клеток или всей популяции в целом в ответ на изменяющиеся Условия окружающей среды. Такого рода изменчивость позволяет мик-робным популяциям быстро адаптироваться к окружающей среде сохранять на должном уровне свою жизнеспособность.
Модификации проявляются в изменении морфологических, биохимических и многих других признаков с последующей их реверси, ей к первоначальному фенотипу после устранения действия фактор вызвавшего их образование, поскольку исчезает потребность в сохранении данной модификации.
Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов, заключающийся в индукции и репрессии соответствующих структурных генов, контролируемых регуляторными генами. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее ферментации. Стафилококки только в присутствии пенициллина синтезируют фермент, разрушающий данный антибиотик.
К модификациям можно отнести включение «молчащих» генов (без их перестройки) некоторых микроорганизмов, в результате чею происходит смена их антигенов (см. 13.3) в ходе инфекционного заболевания.
К модификациям можно отнести также запрограммированные изменения генетической информации, в основе которых лежат миграции гена на хромосоме и встраивание его с разной частотой в определенные локусы, в результате чего происходит изменение признаков. Существует и механизм возврата гена к исходной локализации, что приводит к восстановлению этого признака. К модификациям такого рода относятся изменения антигенной структуры гонококка, трепонемы сифилиса, боррелий возвратного тифа, холерного вибриона.
Модификации могут возникать под непосредственным действием антибиотиков, например пенициллина. Образующиеся при этом 1-формы бактерий, лишенные клеточной стенки, могут сохраняться и даже размножаться внутри клеток хозяина и вновь реверсировать к исходной форме после прекращения действия пенициллина. При выращивании многих бактерий на питательной среде с суббактерио-статическими концентрациями антисептиков также можно получить их модификации, характеризующиеся изменением морфологических или других признаков.
25. Мутационная изменчивость. Генетические рекомбинации. Практическое значение изменчивости микроорганизмов. Понятие о генной инженерии и биотехнилогии
Мутации представляют собой изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закрепленной утрате или изменении какого-либо признака (признаков).
Мутации можно классифицировать по происхождению, характе ру изменений в первичной структуре ДНК, фенотипическим по-едствиям для мутировавшей бактериальной клетки и другим признакам.
По происхождению мутации можно условно подразделить на спонтанные и индуцированные. Первые составляют стественный, или спонтанный, фон, величина которого колеблется в зависимости от типа мутации и вида микробной популяции. Они появляются в микробных популяциях in vitro и in vivo (в естественных биотопах организма человека) под влиянием самых разнообразных причин и событий, например ошибок в работе репарирующих ферментов (см. 6.6), или ДНК-полимеразы во время репликации ДНК. Мутации происходят в результате ошибочного включения в синтезируемую дочернюю цепь вместо одного азотистого основания другого, некомплементарного имеющегося в родительской цепи, например вместо аденина, комплементарного тимину, гуанина или цитозина.
Причиной изменения естественного фона могут быть инсертаци-онные мутации (англ. insertion -- вставка), которые возникают при встраивании в хромосому микробной клетки Is-последовательностей, транспозонов и плазмид. При этом фенотип мутации зависит от места их интеграции: если она происходит вблизи промотора, то нарушается функция регуляторного гена, а вблизи структурного гена -- синтез закодированного в нем продукта. При наличии у бактерий генов-мутаторов частота мутаций увеличивается в 100 и более раз.
Индуцированными называют мутации, которые получают в эксперименте под влиянием каких-либо мутагенов.
По количеству мутировавших генов различают генные и хромосомные мутации. Первые затрагивают один ген и чаще всего являются точковыми, вторые распространяются на несколько генов.
Точковые мутации представляют собой замену или вставку пары азотистых оснований в ДНК, которая приводит к изменению одного кодона, вследствие чего вместо одной аминокислоты кодируется другая либо образуется бессмысленный кодон, не кодирующий ни одну из аминокислот. Последние называют нонсенс мутациями.
Мутации со вставками или выпадениями одной пары азотистых оснований ведут к изменению всех последующих кодонов. Такие мутации называются мутациями со сдвигом считывания. Они также затрагивают один ген.
У микроорганизма, несущего точковую мутацию в одном гене, Может возникнуть вторичная мутация в этом же гене, в результате которого произойдет восстановление дикого фенотипа. При этом пер-ВДчную мутацию, которая привела к.возникновению мутантного фенотипа, называют п р я м о й, а мутацию, обусловившую возврат к Дикому фенотипу, -- обратной. Это может произойти, если пря-мое мутационное изменение состоит в простой замене пары основа, ний в первично мутировавшем гене. Так, если прямая мутация ^ результат замены пары AT на ГЦ, то обратная мутация -- результат замены пары ГЦ на AT.
При истинной реверсии восстанавливается не только фенотип, н0 и генотип. Восстановление одного фенотипа может произойти и в результате супрессии, т.е. подавления мутантного фенотипа, которое выражается в исправлении мутационного изменения. Так, например1 если при первой мутации произошла вставка или выпадение пары нуклеотидов в одном из участков ДНК одного и того же гена, а в другом мутация противоположного рода (выпадение или вставка), ю правильность считывания информации восстанавливается. Такая супрессия называется внутригенной.
При внегенной супрессии вторичные мутации, подавляющие выражение первичного мутационного изменения, локализованы в так называемых генах-супрессорах, кодирующих синтез транспортных РНК (гРНК). Мутации в таком виде могут привести к изменению 7РНК, в результате чего в синтезируемый полипептид доставляется нужная аминокислота. При этом происходит восстановление фенотипа, но не генотипа.
Хромосомные мутации носят характер крупных перестроек в отдельных фрагментах ДНК. Они возникают в результате выпадения меньшего или большего числа нуклеотидов (делеция), либо поворота участка ДНК на 180° (инверсия), либо повторения какого-либо фрагмента ДНК (дупликация). Один из механизмов образования хромосомных мутаций связан с перемещением Is-после-довательностей и транспозонов из одного участка ДНК в другой или из репликона в репликон (из хромосомы в плазмиду и наоборот).
В результате возникает мутация, так как функция гена при включении транспозируемого элемента нарушается. При перемещении они могут вызывать делеции или инверсии генетического материала, а при включении в новый участок ДНК -- дупликации в 6-9 пар нуклеотидов.
По фенотипическим последствиям мутации подразделяют на нейтральные, условно-летальные и летальные. Нейтральны' мутации фенотипически не проявляются какими-либо изменениями признаков, поскольку они заметно не отражаются на функциональной активности синтезируемого фермента.
Мутации, которые приводят к изменению, но не к утрате функци ональной активности фермента, называют условно-летальным и. В зависимости от условий окружающей среды микроорганизмы могут сохранять свою жизнеспособность или, наоборот, утра чивать ее. Так, например, ts-мутанты (температурочувствительные) бактерий сохраняют способность к синтезу ферментов функционирующих при 37°С, но утрачивают этот признак при 42 С. В то же время у бактерий бмдерий дикого типа соответствующие ферменты активны при обеих температурахх.
Детальные мутации характеризуются полной утратой способности синтезировать жизненно важный для бактериальной клетки фермент или ферменты. Чаще всего эти мутации возникают при обширных делециях, захватывающих группу генов, или при других видах хромосомных мутаций. К ним относятся также мутации в генвх, несущих информацию о синтезе ДНК-полимераз.
Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменения м0нфологических и биохимических признаков, например жгутиков, пилей, капсулы, клеточной стенки; способности ферментировать какие-либо углеводы, синтезировать определенные аминокислоты, витамины и другие соединения, возникновении устойчивости к лекарственным или дезинфицирующим веществам и т.д.
Мутанты, нуждающиеся в определенных аминокислотах, азотистых основаниях, ростовых факторах, называются ауксотроф-н ы м и. Они могут сохранять способность к росту лишь в том случае, если утрата соответствующего фермента (ферментов) компенсируется наличием в среде готового продукта, образуемого при его непосредственном участии.
26. Молекулярная гибридизация. Полимеразная цепная реакция
Метод основам на выявлении в биоматериале от больного из внешней среды или препарат из чистых культур после донательноетъю нуклеиновых кислот (МЮ. определение их рода, вила и типа специфичности Применяют два метола:
I. Молекулярная гибридизация (MB) процесс, в котором одноцепочечная ПК исследуемою микроорганизма (мишень) при взаимодействии с комплементарным фрагментом ПК. включающей метку (зонд) образует двухцепочечный комплекс Назначение метода: