Автореферат: Мутации с изменением копийности в генах PARK2 и SNCA при болезни Паркинсона в России

На правах рукописи

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МУТАЦИИ С ИЗМЕНЕНИЕМ КОПИЙНОСТИ В ГЕНАХ PARK2 И SNCA ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА В РОССИИ

Семенова Елена Владимировна

МОСКВА - 2010

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН (зав. отделом доктор биологических наук, профессор С. А. Лимборская).

Научный руководитель: кандидат биологических наук Мария Игоревна Шадрина ИМГ РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Валерий Вячеславович Носиков ФГУП «ГосНИИгенетика»

доктор биологических наук, профессор Игорь Анатольевич Гривенников ИМГ РАН

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится « » _____________ 2010 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Россия, Москва, 1-ый Дорожный проезд д.1. Тел: (495)315-3747.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан « » 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Т. Л. Воюшина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

На современном этапе достигнут большой прогресс в идентификации генов, вовлеченных в этиологию моногенных наследственных болезней. Это связано, как с успешным применением стратегии позиционного клонирования и развитием новых технологий, так и с успехами, достигнутыми в расшифровки генома человека. Основной проблемой сейчас является выявление генов, вовлеченных в патогенез мультифакториальных заболеваний. К такому типу заболеваний относятся, прежде всего, болезни сердечно-сосудистой системы, астма, сахарный диабет, многие нейропсихиатрические и неврологические заболевания. Особый интерес представляет изучение молекулярно-генетических основ мультифакториальных неврологических заболеваний, поскольку это позволит, во-первых, выявить новые закономерности в функционировании нервной системы на всех уровнях - от уровня клетки до организма в целом. Кроме того, выявление генетических маркеров данных заболеваний поможет разработать новые методы их диагностики. Разрабатываемые методы лечения и профилактики, в свою очередь, будут максимально учитывать генетические особенности каждого конкретного человека.

К числу тяжелых неврологических патологий относится болезнь Паркинсона (БП), которая является вторым по распространенности (после болезни Альцгеймера) нейродегенеративным заболеванием человека. Болезнь Паркинсона - это мультисистемное хроническое медленно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, связанное с нарушением деятельности базальных ганглиев головного мозга. В настоящее время полагают, что в основе БП лежит дегенерация или дисфункция дофаминергических нейронов в черной субстанции, однако причины такой избирательной гибели нейронов полностью не выяснены.

С генетической точки зрения БП представлена двумя формами: семейной и спорадической. В 10-15% случаев заболевание может наследоваться по моногенному аутосомному типу, но в большинстве случаев носит спорадический идиопатический характер. В настоящее время картировано 17 локусов моногенных форм болезни Паркинсона. Анализ известных локусов и генов БП позволил выделить несколько механизмов, вовлеченных в патогенез паркинсонизма. К их числу, в первую очередь, относятся процессы убиквитин зависимой протеасомной деградации белков, которые часто связаны с мутациями в генах паркина (PARK2) и б-синуклеина (SNCA). Известно, что гомозиготность или компаундная гетерозиготность по мутациям в гене PARK2 является причиной развития заболевания у примерно половины больных с ювенильной аутосомно-рецессивной формой БП и у примерно 10% спорадических больных с ранним началом развития заболевания. Более того, установлено, что даже в гетерозиготном состоянии мутации в гене PARK2 могут вести к субклиническим нарушениям обмена дофамина в полосатом теле. Эти данные позволяют предположить, что гетерозиготность по мутациям в гене PARK2 может приводить к БП или повышать риск ее развития при взаимодействии с другими факторами. Для проверки этой гипотезы необходимо проведение массового скрининга мутаций в гене PARK2 у больных спорадической формой БП. Интересной особенностью мутаций в этом гене является высокая частота делеций или дупликаций, захватывающих целиком один или несколько экзонов. Следовательно, анализ мутаций гена PARK2 целесообразно начинать именно с поиска экзонных делеций и дупликаций. Также, сравнительно недавно появились данные о том, что мутации гена SNCA, связанные с изменением его копийности, могут приводить к развитию семейной формы БП с аутосомно-доминантным типом наследования. Было показано, что дупликации и трипликации гена SNCA встречаются гораздо чаще, чем точковые мутации данного гена.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось оценить вклад делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 и мультипликаций гена SNCA в развитие болезни Паркинсона у пациентов из России. Для этого были поставлены следующие задачи:

· Разработка быстрого и эффективного метода анализа дозы отдельных экзонов гена PARK2 и гена SNCA на основе ПЦР в реальном времени.

· Анализ делеций и дупликаций всех 12 экзонов гена PARK2 у пациентов со спорадической формой БП с ранним и поздним началом развития заболевания.

· Оценка риска развития спорадической БП у носителей делеций/дупликаций экзонов гена PARK2. Анализ корреляции мутаций с изменением копийности с клиническими характеристиками БП.

· Анализ дупликаций и трипликаций экзонов 4-6 гена SNCA в выборке пациентов с БП.

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработан быстрый и эффективный метод выявления делеций и дупликаций экзонов 1-12 в гене PARK2 и мультипликаций гена SNCA на основе ПЦР в реальном времени технологии TaqMan.

Впервые проведен анализ спорадических больных с ранним началом развития заболевания (<45 лет) из России на наличие экзонных перестроек в гене PARK2. Установлено, что частота больных с экзонными перестройками в гене PARK2 составляет 12,4%, и показано, что наиболее подвержены экзонным перестройкам экзоны 3 и 4. Обнаружено, что относительный риск развития БП у лиц в молодом возрасте при наличии делеций или дупликаций в гене PARK2 повышен в 12,4 раза. Получено подтверждение гипотезы о том, что мутации в гетерозиготном состоянии в гене RARK2 влияют на риск развития заболевания.

Впервые проведен анализ представительной выборки спорадических больных с поздним началом развития заболевания (?45 лет) из России на наличие экзонных перестроек в гене PARK2. Установлено, что частота больных с экзонными перестройками в гене PARK2 составляет 3,8%.

Впервые в российской популяции проведен корреляционный анализ в выборках спорадических больных с ранним и поздним началом развития заболевания между наличием экзонных перестроек в гене PARK2 и характерными клиническими признаками БП. Установлено, что наличие экзонных перестроек способствует существенному снижению возраста начала БП (на 9 лет), развитию дистонии и симметричному протеканию заболевания и не влияет на скорость и тяжесть протекания болезни.

Впервые проведен анализ больных с семейной формой БП с аутосомно-доминантным типом наследования на наличие дупликаций и трипликаций гена SNCA. В результате анализа было показано, что мультипликации гена SNCA не вносят существенного вклада в патогенез БП у больных из России.

Показано, что экзонные перестройки в гене PARK2 вносят существенный вклад в патогенез БП у больных из России. Разработан эффективный метод их выявления, подходящий, в том числе, для массового скрининга больных в клинических условиях. Выявление данных мутаций на ранних стадиях заболевания может скорректировать терапию и при грамотном лечении значительно уменьшить тяжесть его протекания. Выявление таких мутаций у лиц из группы риска на доклинической стадии поможет вовремя принять профилактические меры и, если не предотвратит развитие БП, то отодвинет ее появление на более поздний срок и значительно снизит тяжесть протекания заболевания. В будущем, в том числе с использованием результатов данного исследования, возможно создание единого комплексного генетического теста, выявляющего риск развития БП по результатам анализа локусов заболевания.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 4 статьи и 4 материала конференций и симпозиумов.

Апробация диссертации

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на конференциях Европейского Общества Генетики человека (ESHG) в 2006, 2007 и 2009 гг., на IX Международном симпозиуме по мутациям в геноме (IX International Symposium on Mutations in the Genome, Китай) в 2007 г., на второй Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биотехнология» в 2006 г. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании Ученого совета ИМГ РАН 19 апреля 2010 г. и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» 28 апреля 2010 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает введение; обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение; заключение; выводы; библиографический указатель. Список литературы состоит из 249-ти источников, среди которых 11 источников отечественной и 238 источников зарубежной литературы. Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста, содержат 17 таблиц и 6 рисунков.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В настоящей работе был проведен анализ трех групп больных: 170 спорадических больных БП с ранним началом развития заболевания, 183 спорадических больных БП с поздним началом развития заболевания и 61 больного БП из семей с аутосомно-доминантным типом наследования из России. Все больные являлись русскими по происхождению и для постановки диагноза БП были исследованы по международной унифицированной оценочной шкале болезни Паркинсона (Unified Parkinson's Disease Rating Scale, UPDRS) [Fahn et al., 1987] и шкале Hoehn Yahr (Hoehn and Yahr scores) [Goetz et al., 2004] в Научном центре неврологии Российской академии медицинских наук, г. Москва. Клинические характеристики спорадических больных БП с ранним и поздним началом развития заболевания представлены в таблице 1. В качестве популяционного контроля была сформирована выборка в количестве 100 человек, для которой отбирались лица из русской популяции (Тверская и Ивановская области) в возрасте от 30 до 50 лет. Все образцы крови были взяты с информированного согласия исследуемых лиц. Для анализа брали венозную кровь, из которой стандартным методом выделяли геномную ДНК из лейкоцитов периферической крови [Miller et al., 1988].

Анализ дозы экзонов 1-12 гена PARK2 и экзонов 4-6 гена SNCA проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов. Праймеры и зонды подбирали с помощью программы Vector NTI Suite 9 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), Beacon Designer 6 и нуклеотидных последовательностей гена PARK2 (GenBank Accession number AB009973) и гена SNCA (GenBank Accession number AF163864). В качестве референсного гена был выбран ген в-глобина (НВВ), так как в нем крайне редко встречаются делеции и дупликации. Ген HBB, праймеры и зонды для которого были описаны ранее Lo и соавторами [Lo et al., 1998] (таблица 2), амплифицировали совместно с каждым отдельным экзоном гена PARK2/SNCA. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей: 10-20 нг геномной ДНК; 2,5 мкл ПЦР буфер (10х) (Syntol, Москва, Россия); 2,5 мкл 25 мМ MgCl2; 10 пM праймеров (Syntol, Москва, Россия); 4 пМ зонда (Syntol , Москва, Россия); 200 мкM каждого дНТФ; 1,25 единиц активности Hot-Rescue Taq ДНК-полимеразы (Syntol, Москва, Россия). Для проведения амплификации использовали следующий режим: 50 °C - 30 сек., 95 °C - 90 сек., далее 50 циклов 60°C, 50 сек. и 95 °C, 15 сек. Последовательности праймеров и зондов для экзонов 1-12 гена PARK2 и экзонов 4-6 гена SNCA, а также температура отжига приведены в таблице 2.

Таблица 1. Клинические характеристики спорадических больных БП с ранним и поздним началом развития заболевания.