Автореферат: Мутации с изменением копийности в генах PARK2 и SNCA при болезни Паркинсона в России

Интенсивность флуоресценции ПЦР-продуктов измерялась с помощью амплификатора АНК-32 (Институт аналитического оборудования, Санкт-Петербург, Россия). Для расчетов использовали значение порогового цикла (Ct), которое рассчитывалось с использованием принципа второй производной. Все образцы исследовали трижды. Полученные значения усреднялись и вычислялось среднее значение Сt (?Ct) и стандартное отклонение (SD).

Далее для определения числа копий исследуемого экзона гена PARK2/SNCA мы проводили сопоставление величин порогового цикла для экзонов гена PARK2/SNCA и одновременно амплифицируемого с ним гена HBB при помощи коэффициента R, который рассчитывался по формуле, предложенной Livak [Livak, 1997]:

RPARK2(SNCA)/ HBB = 2 -(ДДCt)

где (ДДCt) = [CtHBB (контрольный образец ДНК) - CtPARK2(SNCA) (контрольный образец ДНК)] - [CtHBB (образец ДНК больного) - CtPARK2(SNCA) (образец ДНК больного)].

Для определения числа копий экзонов гена PARK2 использовались следующие известные диапазоны значений коэффициента R:

· 0,7<R<1,3 - свидетельствует об отсутствии делеций и дупликаций;

· 0,4<R<0,6 - свидетельствует о наличии делеции в гетерозиготном состоянии;

· R>1,4 - свидетельствует о наличии дупликации;

· R<0,2 - свидетельствует о наличии делеции в гомозиготном состоянии.

Относительные риски (ОР) развития БП были посчитаны с использованием программы GraphPad InStat 3.06 по формуле:

ОР = [A/(A+B)] / [C/(C+D)],

где A - число лиц с наличием мутации, B - с отсутствием мутации среди больных; C и D - число лиц, соответственно, с наличием и отсутствием мутации среди здоровых.

Статистически значимыми считали относительные риски при р<0,05 [Реброва, 2002].

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов для гена НВВ, экзонов 1-12 гена PARK2 и экзонов 4-6 гена SNCA с температурой отжига. FAM - флуоресцентный краситель, ROX - флуоресцентный краситель, RTQ1 - тушитель флуоресценции, BHQ2 - тушитель флуоресценции.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ “Statistica for Windows 8.0” и программного обеспечения MS Excel 2007 (Microsoft). Для выявления корреляций между делециями/дупликациями гена PARK2 и клиническими характеристиками больных был использован ранговый коэффициент корреляции по Спирмену (Spearman Rank Order Correlations). Для дальнейшей оценки статистической значимости выявленных корреляций использовали тест Манна-Уитни (Mann-Whitney U Test) и метод ч2. Статистически значимыми считали корреляции при р<0,05 [Реброва, 2002].

Результаты исследования

Подбор праймеров и оптимизация метода анализа дозы отдельных экзонов генов PARK2 и SNCA.

Для определения дозы отдельных экзонов генов PARK2 и SNCA нами был выбран метод ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов. Использование TaqMan зондов позволяет проводить совместную амплификацию исследуемого и референсного генов, что значительно повышает точность и скорость анализа. Для проведения ПЦР анализа были подобраны комбинации праймер-зонд для 1-12 экзонов гена PARK2 и 4-6 экзонов гена SNCA. Результаты подбора праймеров для соответствующих экзонов генов PARK2 и SNCA представлены в таблице 2. Для определения числа копий экзонов генов PARK2 и SNCA использовались известные диапазоны значений коэффициента R, подтверждение которых было получено нами при анализе ДНК контроля и больных ювенильным паркинсонизмом с типированными ранее гетерозиготными делециями экзонов гена PARK2 [Illarioshkin et al., 2003].

Таким образом, предложенный нами вариант быстрой молекулярной диагностики делеций и дупликаций отдельных экзонов гена PARK2 и мультипликаций гена SNCA ранее описан не был. ПЦР в реальном времени на основе технологии TaqMan обладает целым рядом преимуществ перед другими имеющимися методами. Совместная амплификация отдельных экзонов гена PARK2/SNCA с геном HBB, используемым в качестве референсного гена, и оценка количества ДНК с помощью метода второй производной, учитывающей эффективность реакции, значительно повышают точность анализа и обеспечивают хорошую воспроизводимость результатов. Быстрота исполнения, точность в определении числа копий экзонов, относительно недорогая стоимость и безопасность данного метода делают возможным его применение для массового анализа больных.

Анализ делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 в выборке cпорадических больных болезнью Паркинсона с ранним началом развития заболевания.

При анализе 170 спорадических больных БП с ранним началом развития заболевания (<45 лет) был выявлен 21 больной (12,4%), носители делеций и дупликаций экзонов гена PARK2. Распределение выявленных нами делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 представлено на рисунке 1.

Рисунок 1. Распределение делеций и дупликаций в гене PARK2 при анализе 170 спорадических больных БП с ранним началом развития заболевания.

Из представленных данных видно, что в рассматриваемой группе больных с наибольшей частотой встречаются делеции в гетерозиготном состоянии, как единичных экзонов, так и групп экзонов гена PARK2. Они были найдены у 15 больных (8,8%). Подобные делеции отдельных экзонов были найдены у 7 больных: экзон 2 (больные 16, 17), экзон 3 (больной 6, 21), экзон 4 (больной 13), экзон 7 (больной 12), экзон 9 (больной 12), экзон 11 (больной 11). Делеции групп экзонов гена PARK2 были обнаружены у 7 больных: экзоны 2-4 (больные 4, 14, 18), экзоны 3-4 (больные 3, 10), экзоны 3-5 (больной 7), экзоны 3-7 (больной 1). А также был выявлен 1 больной (больной 15), у которого, наряду с делецией отдельного экзона (экзон 12), присутствовала делеция группы экзонов (экзоны 3-4). Необходимо отметить, что с помощью нашего метода на основе TaqMan ПЦР в реальном времени нельзя напрямую определить, являются ли делеции групп экзонов в гетерозиготном состоянии протяженными делециями, затрагивающими одну хромосому, или сложными компаундными делециями. Такая оценка с использованием разработанного нами метода возможна лишь при совместном анализе больных и их близких родственников, ДНК которых в большинстве случаев была недоступна. В нашем случае ДНК близких родственников больных была нам недоступна. К тому же, необходимо подчеркнуть, что в данном исследовании нас интересовала, в первую очередь, оценка частоты больных с делециями и дупликациями экзонов гена PARK2, а не точная характеристика мутаций в каждом конкретном случае.

Помимо делеций в гетерозиготном состоянии в анализируемой группе больных, у 3 больных (1,8%) были выявлены делеции в гомозиготном состояний. Были обнаружены 2 единичные делеции в гомозиготном состоянии: экзон 3 (больной 5) и экзон 4 (больной 2), и одна делеция экзонов 3-4 (больной 19).

Как видно из рисунка 1 и таблицы 3, наиболее часто делетируемыми экзонами гена PARK2 в данной группе больных являются экзоны 3 и 4.

В результате анализа экзонов гена PARK2 дупликации были найдены у 4 больных: экзон 2 (больной 20), экзон 3 (больной 12) и экзон 5 (больные 8, 9) (рисунок 1). Все дупликации были выявлены в гетерозиготном состоянии. Таким образом, дупликации в гене PARK2 у спорадических больных БП с ранним началом развития встречаются достаточно редко, и частота больных, носителей дупликаций, составляет 2,4%. Частоты больных с дупликациями экзонов гена PARK2 представлены на таблице 4.

Таблица 3. Частота больных с делециями экзонов гена PARK2 в выборке 170 спорадических больных БП с ранним началом развития заболевания.

Таблица 4. Частота больных с дупликациями экзонов гена PARK2 в выборке 170 спорадических больных БП с ранним началом развития заболевания.

Таким образом, наше исследование показало, что частота больных спорадической формой БП с ранним началом развития заболевания из России, являющихся носителями делеций/дупликаций экзонов гена PARK2, значительно превышает частоты больных с экзонными перестройками в гене PARK2 в большинстве популяций мира. Так, частота спорадических больных ранней формой БП с мутациями данного типа в популяциях из Европы составляет от 1,3% (Сербия) до 5,5% (Италия) и 6% (Германия) [Djarmati et al., 2004; Sironi et al., 2008; Kann et al., 2002]. Среди экзонных перестроек гена PARK2 при спорадической БП с ранним началом развития наиболее часто встречались перестройки экзонов 3 и 4. Наши данные согласуются с данными Periquet и соавторов (2003), также показавших, что в гене PARK2 наиболее часто встречаются перестройки экзонов 3 и 4 [Periquet et al., 2003]. Наиболее распространенным типом экзонных перестроек экзонов 3 и 4 гена PARK2 являлись делеции. Из структуры паркина известно, что экзоны 3 и 4, соответствуют двум функциональным фрагментам этого белка: паркин-специфическому домену (UPD) и участку, который содержит сайт, узнаваемый проапоптотическими каспазами 1 и 8. Делеция одного или группы экзонов гена может приводить к возникновению сдвига рамки считывания. Вследствие этого аминокислотная последовательность белка от участка, кодируемого делетированным фрагментом гена до конца полипептидной цепи, будет полностью изменена. Измененный участок белка, а часто и весь белок, в свою очередь, утратит функциональность. Если же подобная делеция не приведет к сдвигу рамки считывания, то в транслируемом белке будут отсутствовать домены, соответствующие делетированной области гена. Применительно к делеции какого-либо из экзонов 3 и 4 гена PARK2 это означает, что в полипептидной цепи белка будет значительно сокращен участок, соединяющий RING-IBR-RING домены, обеспечивающие убиквитин-лигазную активность паркина, и убиквитин-подобный (UBL) домен, взаимодействующий с протеасомным комплексом [Kahle, Haass, 2004]. Подобное нарушение первичной структуры белка обязательно вызовет изменение пространственного взаиморасположения этих доменов. Это, в свою очередь, уменьшит эффективность связывания паркина со своими субстратами и 26S протеасомой. Таким образом, рассматриваемые делеции 3 и 4 экзонов могут приводить к нарушению функционирования системы убиквитин-зависимой деградации белков и развитию нейродегенеративных процессов при БП.

Полученные данные свидетельствуют о важной роли делеций экзонов гена PARK2 в патогенезе спорадической БП с ранним началом развития у больных из России. Дупликации экзонов гена PARK2 встречаются редко и не вносят существенного вклада в патогенез заболевания.

Анализ делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 в выборке спорадических больных болезнью Паркинсона с поздним началом развития заболевания.

При анализе 183 больных БП с поздним началом развития заболевания (?45 лет) было выявлено 7 больных (3,8%), носителей экзонных перестроек гена PARK2. Распределение выявленных нами мутаций представлено на рисунке 2.

Рисунок 2. Распределение экзонных перестроек в гене PARK2 при анализе 183 спорадических больных БП с поздним началом развития заболевания.

Из представленных данных видно, что в рассматриваемой группе больных были найдены только делеции гена PARK2 в гетерозиготном состоянии. При этом были обнаружены делеции как отдельных экзонов, так и делеции групп экзонов гена PARK2. Делеции отдельных экзонов были найдены у 3 больных: экзон 5 (больные 2, 7), экзон 6 (больной 1). Делеция групп экзонов была обнаружена у 1 больного: экзоны 3-4 (больной 4). Также были выявлены 3 больных, у которых, наряду с делециями отдельных экзонов, присутствовали делеции групп экзонов. Это больной 3 (экзоны 2-3, 7), больной 5 (экзоны 4-5, 7) и больной 6 (экзоны 4-5, 7). Как видно из рисунка 2 и таблицы 5, явного преобладания частоты делеций какого-либо экзона гена PARK2 не наблюдалось. Делеции в гомозиготном состоянии и дупликации экзонов гена PARK2 при анализе данной группы больных выявлены не были. экзон ген полимеразный паркинсон

Таблица 5. Частота больных с делециями экзонов гена PARK2 в выборке 183 спорадических больных БП с поздним началом развития заболевания.

Частота больных спорадической формой БП с поздним началом развития заболевания с делециями экзонов гена PARK2 (3,8%) сопоставима с результатами полученными в другом исследовании нашей лаборатории [Сломинский и соавт., 2003]. В этом исследовании были проанализированы больные из Башкирии с поздней формой БП, частота больных с делециями в гетерозиготном состоянии составила 5,3%. В мире экзонные перестройки в гене PARK2 при спорадической БП с поздним началом развития исследованы мало. В популяции из Индии делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 при поздней спорадической форме БП обнаружено не было [Chaudhary et al., 2006]. В большинстве же популяций мира таких исследований не проводилось.