Автореферат: Мутации с изменением копийности в генах PARK2 и SNCA при болезни Паркинсона в России

Полученные нами данные позволяют сделать вывод, что экзонные перестройки в гене PARK2 вносят существенный вклад в патогенез БП у спорадических больных из России, в особенности у больных с ранним началом развития заболевания. Можно предположить, что делеции в гомозиготном состоянии и дупликации экзонов гена PARK2 приводят к более раннему развитию заболевания, и, таким образом, их отсутствие в выборке спорадических больных с поздним началом развития БП объяснимо. Также наше исследование показало, что наш метод на основе ПЦР в реальном времени технологии TaqMan применим для быстрой и точной детекции экзонных перестроек в гене РARK2. Это делает возможным его применение для проведения массового скрининга больных на наличие данных мутаций в клинических условиях. Клиническую диагностику экзонных перестроек в гене PARK2 целесообразно начинать с анализа наиболее делетируемых экзонов, в первую очередь, с экзонов 3 и 4.

Анализ делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 в выборке популяционного контроля и расчет относительных рисков развития болезни Паркинсона в российской популяции.

Помимо анализа делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 у больных спорадической формой БП, было также проанализировано 100 здоровых людей из России, взятых в качестве популяционного контроля. В результате исследования была выявлена гетерозиготная делеция экзона 7 у 1 человека - женщины 37 лет (RPARK2/HBB±SD=0,51±0,04). Таким образом, частота лиц с экзонными перестройками в гене PARK2 составила 1%, что является более низким показателем, по сравнению с частотой больных спорадической БП с ранним (12,4%) и поздним (3,8%) началом развития заболевания. При этом надо учитывать, что для данного человека, носителя гетерозиготной делеции, которому на момент исследования было 37 лет, существует риск развития БП, принимая во внимание средний возраст начала заболевания (60 лет).

Основываясь на данных, полученных в результате анализа групп спорадических больных с ранней и поздней формами БП и контрольной выборки, были рассчитаны относительные риски развития БП у людей с делециями и дупликациями экзонов гена PARK2. Расчеты показали, что по сравнению с нормой у людей с экзонными перестройками вероятность развития ранней формы БП повышена в 12,4 раза. При этом, коэффициент р=0,0022 свидетельствует о высокой достоверности повышения риска развития ранней формы БП. Вероятность развития поздней формы БП у носителей экзонных перестроек гена PARK2 повышена в 3,8 раза, но коэффициент р=0,3195 свидетельствует о том, что такое повышение риска развития поздней формы БП нельзя считать достоверным. Эти данные могут свидетельствовать о том, что экзонные перестройки в гене PARK2 обладают высокой степенью пенетрантности, и их патогенное действие, приводящее к развитию заболевания, начинает проявляться в раннем возрасте. Роль мутаций в гетерозиготном состоянии в гене PARK2 в развитии БП до сих пор остается до конца не выясненной. По результатам нашего исследования можно предположить, что делеции в гомозиготном и гетерозиготном состоянии в гене PARK2 приводят к развитию ранней формы БП, в то время как к позднему развитию БП могут приводить только делеции в гетерозиготном состоянии. Эти результаты согласуются с предположением, выдвинутым Foroud и соавторами, заключающимся в том, что гомозиготность по мутациям в гене PARK2 приводит к развитию заболевания в раннем возрасте, тогда как гетерозиготность по мутациям в гене PARK2 может приводить к позднему развитию заболевания [Foroud et al.,2003]. Это предположение подтверждают и данные, полученные в других исследованиях. Так, в 2000 году Klein и соавторы описали семью с поздним началом развития паркинсонизма дрожательного типа, в которой развитие заболевания было связано с мультиэкзонной делецией в гетерозиготном состоянии в гене PARK2 [Klein et al., 2000]. А в работе Сломинского и соавторов (2003) была выявлена делеция в гетерозиготном состоянии экзона 12 гена PARK2 у 2 больных спорадической формой БП с поздним началом развития [Сломинский и соавт., 2003]. Также результаты нашего исследования показали, что помимо того, что делеции экзонов в гетерозиготном состоянии гена PARK2 могут приводить к развитию поздней формы БП, их наличие может повышать риск развития БП в раннем возрасте. Наши данные согласуются с исследованием Clark и соавторов, включавшим анализ 101 больного со спорадической БП с ранним началом развития и 105 человек контрольной выборки, и показавшим, что мутации в гетерозиготном состоянии в гене PARK2 могут повышать риск развития ранней формы БП [Clark et al., 2006]. Это может быть связано с тем, что в гетерозиготном состоянии мутация в гене PARK2 может приводить к развитию болезни из-за недостаточного синтеза белка и его сниженной активности. Такая гипотеза была высказана West и соавторами в 2002 году [West et al., 2002].

Выявление корреляций между наличием делеций/ дупликаций экзонов гена PARK2 и клиническими характеристиками больных.

Все больные были оценены по следующим критериям: полу, возрасту на момент исследования, возрасту начала заболевания, длительности заболевания, UPDRS, стадии Hoehn Yahr, Schwab активности, формам БП, MMSE, скорости прогрессирования заболевания, наличию или отсутствию дистонии, ассиметрии или дискинезии. Клинические характеристики больных с ранним и поздним началом развития БП приведены в таблице 1. Был проведен корреляционный анализ в выборках спорадических больных с ранним и поздним началом развития БП с целью выявления корреляций между наличием делеций/дупликаций экзонов гена PARK2 и клиническими характеристиками больных. Корреляционный анализ проводился с использованием ранговой корреляции по Спирмену, его результаты представлены в таблице 6.

В выборке больных с ранним началом развития заболевания были выявлены корреляции между наличием делеций/дупликаций экзонов гена PARK2 и возрастом больных на момент исследования, возрастом начала заболевания, длительностью заболевания и развитием дистонии. Корреляционный анализ не выявил корреляций с полом, стадиями по шкалам UPDRS и Hoehn Yahr, активностью по шкале Schwab & England, формами болезни, результатами MMSE, скоростью прогрессирования заболевания, наличием ассиметрии и дискинезии (таблица 6). Наибольший интерес представляют корреляции с возрастом начала заболевания и наличием дистонии. Возраст на момент исследования и длительность заболевания являются производными от возраста начала заболевания. Более детальный анализ корреляции с возрастом начала БП показал, что средний возраст начала заболевания носителей экзонных перестроек составляет 24±11 лет, в то время как средний возраст начала заболевания людей с отсутствием мутаций подобного типа составляет 33±9 лет. Таким образом, показано, что носители экзонных перестроек заболевают в среднем на 9 лет раньше (рисунок 3). Достоверность этой корреляции была подтверждена тестом по Манну-Уитни (р=0,000130). Таким образом, была выявлена прямая связь между наличием экзонных перестроек в гене PARK2 и возрастом начала заболевания. Наши данные согласуются результатами исследования Sun и соавторов, показавшего, что у больных с мутацией в гене PARK2 болезнь развивалась почти на 12 лет раньше, чем у больных без мутаций в нем [Sun et al., 2006].

Также, в выборке спорадических больных с ранней формой БП был проведен подробный анализ корреляции между наличием делеций/дупликаций экзонов гена PARK2 и развитием дистонии. Так, среди 21 больного, у которых были обнаружены экзонные перестройки в гене PARK2, было выявлено 8 больных с дистонией и 13 больных без нее. Анализ 149 больных без экзонных перестроек выявил 22 больных с наличием дистонии и 127 с ее отсутствием. В результате оценки частоты больных с дистонией и без нее при наличии/отсутствии экзонных перестроек в гене PARK2 по методу ч2 было показано, что наличие делеций и дупликаций способствует развитию дистонии (р=0,0203).

Таблица 6. Коэффициенты ранговой корреляции по Спирмену между делециями/дупликациями экзонов гена PARK2 и клиническими характеристиками спорадических больных с ранним и поздним началом развития БП. Жирным крупным шрифтом выделены достоверные корреляции.

Рисунок 3. Корреляция между делециями/дупликациями экзонов гена PARK2 и возрастом начала заболевания у спорадических больных с ранним началом развития БП. 1 - отсутствие мутаций, 2 - наличие мутаций.

Корреляционный анализ в выборке больных с поздним началом развития БП выявил только одну корреляцию между наличием делеций экзонов гена PARK2 и симметричным течением заболевания (таблица 6). Было показано, что у всех 7 больных, носителей делеций в гене PARK2, наблюдалось симметричное течение заболевания, в то время как среди 176 больных без делеций в гене PARK2 было выявлено 89 больных с ассиметрией и 87 без нее. В результате оценки частоты больных с ассиметрией и без нее при наличии/отсутствии делеций по методу ч2 было показано, что наличие делеций способствует симметричному развитию заболевания (р=0,0251).

Таким образом, наличие делеций/дупликаций экзонов гена PARK2 способствует более раннему началу заболевания с симметричным возникновением симптомов и развитием дистонии, но не влияет на такие важные клинические признаки, как тяжесть протекания и скорость прогрессирования БП. Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что делеции и дупликации экзонов гена PARK2 не вносят существенного вклада в формирование большинства клинических признаков заболевания.

Анализ дупликаций и трипликаций гена SNCA в выборке аутосомно-доминантных больных болезнью Паркинсона.

С использованием описанного метода ПЦР в реальном времени на основе технологии TaqMan, проведен анализ 61 больного БП с аутосомно-доминантным типом наследования. Для анализа дупликаций и трипликаций гена SNCA проанализировали экзоны 4, 5 и 6 на наличие экзонных перестроек. При этом для всех трех анализируемых экзонов получены значения коэффициента R, лежащие в диапазоне от 0,76 до 1,21. Эти данные свидетельствуют об отсутствии экзонных перестроек в данных экзонах и, следовательно, отсутствии дупликаций и трипликаций гена SNCA в исследуемой выборке. Наши результаты согласуются с данными исследований, проведенных в США, Германии и Португалии, не выявивших увеличения копий гена SNCA у семей с аутосомно-доминантной формой наследования БП [Bras et al., 2008; Gispert et al., 2005; Johnson et al., 2004]. Более того, скрининг такого рода мутаций у спорадических больных БП в различных популяциях также не выявил носителей дупликаций и трипликаций гена SNCA [Bras et al., 2008; Johnson et al., 2004; Hofer et al., 2005; Nishioka et al., 2006]. По всей видимости, мутации такого типа редки в нашей популяции, и можно предположить, что дупликации и трипликации гена SNCA не вносят существенного вклада в патогенез аутосомно-доминантной формы БП у больных из России. В связи с этим, представляется нецелесообразным дальнейший анализ мультипликаций гена SNCA при спорадической форме БП у больных из России.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее время особое значение приобретают исследования тяжелых нейродегенеративных заболеваний человека, поскольку эти заболевания широко распространены и в большинстве случаев неизлечимы. Современные технологии позволяют попробовать взглянуть на патогенез данных заболеваний с молекулярно-генетической точки зрения, что дает надежду на их выявление на доклинической стадии и разработку эффективных методов профилактики и лечения. Одним из таких заболеваний является болезнь Паркинсона. К настоящему моменту найдены основные локусы семейных форм БП и ведется активный поиск генетических факторов развития гораздо более распространенной спорадической формы БП. Из литературных данных известно, что наиболее частой генетической причиной развития БП являются мутации в гене PARK2, основную долю которых составляют экзонные делеции и дупликации. Также относительно недавно были получены данные о том, что мутации, связанные с увеличением числа копий гена SNCA, могут быть частой причиной развития семейной формы БП с аутосомно-доминантным типом наследования. Высокая частота данных мутаций требует разработки эффективного метода их типирования. В связи с этим нами был разработан быстрый и точный метод выявления экзонных перестроек в генах PARK2 и SNCA, применимый для массового скрининга больных в клинических условиях. Полученные нами данные подтверждают высокую встречаемость экзонных перестроек в гене PARK2 и их важную роль в патогенезе спорадической формы БП, особенно с ранним началом развития, у больных из России. При анализе спектра делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 было установлено, что наиболее часто встречаются экзонные перестройки экзонов 3 и 4. Анализ мультипликаций гена SNCA показал, что данные мутации не играют существенной роли в развитии БП в российской популяции. Таким образом, можно сделать вывод о необходимости анализа делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 (в первую очередь, экзонов 3 и 4) у больных из России, особенно на ранних стадиях заболевания, когда с помощью грамотной терапии возможно замедлить развитие заболевания или уменьшить его тяжесть. Также анализ экзонных перестроек в гене PARK2 может быть очень эффективен на доклинических стадиях у родственников спорадических больных, которые составляют группу риска. В случае выявления экзонных перестроек, им может быть предложена терапия, способная, если не остановить развитие заболевания, то сдвинуть его дебют на более поздний срок и снизить тяжесть его протекания.

1. Разработан основанный на ПЦР в реальном времени метод анализа дозы отдельных экзонов гена PARK2 и гена SNCA, позволяющий проводить диагностику мутаций с изменением копийности при семейной и спорадической формах болезни Паркинсона.

2. Показано, что делеции и дупликации экзонов гена PARK2 встречаются у 21 из 170 (12,4%) обследованных пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона с ранним началом развития (до 45 лет) из России. Наиболее часто у этих больных встречаются делеции экзонов 3, 4 гена PARK2. Риск развития болезни Паркинсона в молодом возрасте у лиц с наличием мутаций с изменением копийности в гене PARK2 повышен в 12,4 раза.

3. У пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона с ранним началом развития выявлены корреляции между наличием мутаций с изменением копийности в гене PARK2, возрастом начала заболевания и наличием дистонии. Показано, что у носителей делеций и дупликаций в гене PARK2 возраст начала заболевания в среднем на 9 лет меньше и составляет 24 года.

4. Показано, что мутации с изменением копийности в гене PARK2 встречаются у 7 из 183 (3,8%) обследованных пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона с поздним началом развития (после 45 лет) из России. В данной выборке больных выявлена корреляция между наличием мутации с изменением копийности в гене PARK2 и симметричным течением заболевания.

5. У 61 обследованного больного с аутосомно-доминантной формой болезни Паркинсона из России не выявлено дупликаций и трипликаций гена SNCA.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шадрина М.И., Семенова Е.В., Сломинский П.А., Иллариошкин С.Н., Багыева Г.Х., Маркова Е.Д., Иванова-Смоленская И.А., Лимборская С.А. Метод определения делеций и дупликаций в гене паркина с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени // Медицинская генетика. 2006. Т. 5(2). С. 52-54.

2. Шадрина М.И., Багыева Г.Х., Иллариошкин С.Н., Семенова Е.В., Сломинский П.А., Загоровская Т.Е., Маркова Е.Д., Федорова Н.В., Проскокова Т.Н., Лимборская С.А., Иванова-Смоленская И.А. Структурные перестройки в гене паркина (PARK2) у больных с паркинсонизмом молодого возраста // Медицинская генетика. 2006. Т. 5(12). С. 22-26.

3. Shadrina M., Semenova E., Slominsky P., Bagyeva G., Illarioshkin S., Ivanova-Smolenskaia I., Limborska S. Effective quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of the parkin gene (PARK2) exon 1-12 dosage // BMC Medical Genetics. 2007. V. 8. P. 6.

4. Семенова Е.В., Шадрина М.И., Сломинский П.А., Иллариошкин С.Н., Багыева Г.Х., Карабанов А.В., Иванова-Смоленская И.А., Лимборская С.А. Анализ изменения дозы гена б-синуклеина при аутосомно-доминантной форме болезни Паркинсона // Генетика. 2009. Т. 45(4). С. 573-576.