Материал: Основы биотехнологии
Рис.5. Крупномаштабный процесс производства фруктозных сиропов из кукурузного крахмала. Типичное предприятие в день перерабатывает около 500 т зерна.Отделенные из зерен гранулы крахмала рессуспендируются в воде до концентрации 40% при рН 3,5–4,2. На стадии разжижения добавляется альфаамилаза и крахмал желируется при рН 6,2–6,5 при прямом нагревании раствора паром. Начальная температура 105–107 0С поддерживается 5–8 минут, затем резко охлаждается до 95 0С и выдерживается 1–2 часа для дальнейшего гидролиза крахмала до размера олигосахаридов в 10–13 глюкозных остатков. Для осахаривания раствор разбавляют до концентрации 32–34% сухого вещества, рН доводят до значения 4,2– 4,5, и глюкоза образуется при добавлении глюкоамилазы и пуллаланазы. Реакция проходит в реакторах при температуре 60 0С. Для изомеризации 95,5% раствор глюкозы доводят до рН 7–8 и пропускают через колону с иммобилизованной глюкоизомеразой. Температура и скорость протока контролируются так, чтобы обеспечить на выходе примерно 42% фруктозный сироп. Высокоочищенная (90%) фруктоза получается путем хроматографического разделения моносахаров.
Использование микроорганизмов в качестве источников производства ферментов стимулируется следующими основными факторами:
•высокой степенью специфической активности в пересчете на единицу сухого веса продукта;
•сезонными колебаниями количества и качества сырьевых материалов и возможностью их длительного сохранения в зависимости от климатических изменений;
•возможностью выбора нужного фермента из широкого спектра микробных катализаторов, характеризующихся различной
81
степенью устойчивости к повышенным температурам рН среды;
•возможностями промышленной генетики оптимизировать количества выхода ферментов и способов селекции штаммовпродуцентов путем мутагенеза, изменения условий культивирования, а также (в последнее время) применения
практически неограниченных возможностей методов генетической инженерии.
Приемы селекции различных микроорганизмов довольно сложны и включают многие факторы, такие, как стоимость культивирования, способность секретировать фермент во внешнюю среду или накапливать его внутри клетки, а также способность противостоять неблагоприятным воздействиям внешней среды, повреждающим ферменты, и т. п. В зависимости от происхождения ферменты существенно различаются между собой по термостабильности и по отношению к экстремальным значениям рН. Так, например, протеазы Bac. subtilis относительно стабильны при нагреваниях и активны в щелочной среде, в силу чего считаются более подходящими для использования в качестве добавок в стиральные порошки и моющие средства. В противоположность этому, грибные амилазы, вследствие их высокой чувствительности к нагреванию, пригодны в хлебопечении и т. д.
При селекции продуцентов ферментов генетики промышленных микроорганизмов стремятся улучшить желаемые их свойства: высокий выход фермента, стабильность фермента, независимость синтеза фермента от индуктора, легкое его извлечение из среды и т. п., тогда как нежелательные качества стараются устранить или ингибировать. К числу последних относятся наличие вредных побочных метаболитов, неприятный запах, нежелательный цвет препарата и т. п. Сложная генетическая техника, однако, еще не нашла широкого применения и большинство производств использует главным образом приемы мутагенеза в сочетании с хорошо отработанными селекционными методами. Общим недостатком большинства промышленных микроорганизмов является их малая генетическая изученность, что, естественно, снижает возможности улучшения полезных свойств продуцентов ферментов за относительно короткий период времени. Однако технология переноса генов вместе с белковой инженерией способны изменить эту ситуацию и обусловить развитие новых направлений в области ферментной технологии.
82
Поскольку микробные ферменты являются малообъемными препаратами относительно невысокой стоимости, методы, применяемые для их производства, обычно осуществляются с использованием биореакторов (ферментеров), аналогичных по конструкции и функциях таковым, которые применяются при производстве антибиотиков. Выбор культуральной среды является весьма важным моментом в процессе производства, так как она обеспечивает растущий микроорганизм энергией, а также является источником необходимых элементов (углерода, азота и т. д.). Стоимость сырьевого материала непосредственно связана с ценой конечного продукта.
Вбольшинстве случаев ферменты получаются при ферментации с одноразовой загрузкой, длящейся от 30 до 150 часов; процессы, основанные на непрерывном (проточном) культивировании, нашли пока еще малое применение в промышленном производстве ферментов.
Впроцессе выращивания продуцентов ферментов, последние могут накапливаться внутри клеток или же секретироваться во внешнюю среду. Коммерческие препараты ферментов могут выпускаться в продажу либо в жидкой, либо в кристаллической форме; очищенными или же в виде "грубых" препаратов. Например, в препаратах, используемых для гидролиза крахмала, целлюлозы, основным критерием является высокая активность основного фермента в препарате, а наличие других активностей зачастую не принимают во внимание. В то же время в препаратах ферментов, используемых в молекулярной биологии, медицине, основным критерием качества является отсутствие дополнительных ферментативных активностей и просто белковых загрязнений.
Концентрирование и очистка ферментов зачастую представляет собой весьма сложные процессы. И естественно, что стоимость препаратов ферментов зависит от всех перечисленных выше моментов.
Ферментные препараты, предназначенные для использования в пищевой промышленности или в медицинской практике, подлежат строгому контролю на токсичность для животных, мутагенную активность, тератогенность и канцерогенность, а также проверяются в различных фармакологических тестах.
Ответственность за безопасность выпускаемых ферментных препаратов ложится на фирму, их производящую. Практически, безопасный ферментный препарат должен обладать низкими аллергическими свойствами и быть свободным от токсических веществ, а также вредоносных микроорганизмов.
83
Иммобилизованные ферменты
В последние 15–20 лет на стыке ряда химических и биологических дисциплин сложилось новое "инженерное" направление – химическая энзимология, стремительное развитие которой было обусловлено созданием биологических катализаторов нового типа – иммобилизованных ферментов. А разработка метода иммобилизованных ферментов определялась, в свою очередь, рядом существенных факторов, затрудняющих использование чистых ферментов во многих промышленных производствах.
Во-первых, чистые препараты ферментов неустойчивы при длительном хранении, а также при разного рода воздействиях, особенно тепловых.
Во-вторых, в виду сложности отделения ферментов от различных реагентов смеси многократное их использование весьма затруднено. Однако принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией с разработкой принципов создания иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании в прикладных (промышленных целях) производствах по сравнению с чистыми препаратами. Гетерогенный (иммобилизованный) катализатор легко отделить от реакционной среды, что обусловливает:
•возможность остановки реакции в любой нужный момент;
•повторное использование катализатора;
•получение конечного продукта, не загрязненного ферментом. Последний момент весьма важен при производстве пищевых и
медицинских продуктов. Применение иммобилизованного катализатора позволяет проводить ферментный процесс непрерывно и регулировать скорость реакции, а также изменять количество получаемого продукта в соответствии с изменениями скорости протока реакционной смеси. Иммобилизация или некоторая модификация фермента может обусловить изменения и некоторых его свойств (специфичность взаимодействия с субстратом; зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, а также его стабильность по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям). Иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность за счет изменения свойств носителя.
Для иммобилизации ферментов используются также различные типы неорганических носителей, таких, как создаваемые на основе силикагеля, глины, керамик, природных минералов, металлов и их оксидов.
84
Основными качествами, определяющими широкое внедрение неорганических носителей в производственные процессы, является легкость их регенерации и возможность придания им любой конфигурации. Они могут применяться как в виде порошков, шариков, так и монолитов; они могут быть как пористыми, так и сплошными (непористыми).
Определенное преимущество для различного рода работ имеют носители, приготавливаемые на основе микропористых кремнеземов. К их достоинствам следует отнести механическую прочность, химическую инертность по отношению ко многим растворителям, наличие жесткого скелета с заданным размером пор, а также устойчивость к микроорганизмам. Недостатками кремнеземов является их использование
вограниченном диапазоне рН, а также явление неспецифической сорбции на их поверхности, хотя последнее может быть устранено различными модифицирующими воздействиями. Правда, стоимость кремнеземных носителей относительно высока, и модификация еще больше повышает цену, поэтому внедрение их в промышленность существенно ограничено.
Более пригодными для промышленного использования могут оказаться природные алюмосиликаты – глины, а также пористая керамика,
всостав которой, помимо алюмосиликатов, входят окислы титана, циркония или другие добавки. Следует также упомянуть такие широко распространенные носители, как уголь и графитированная сажа. Весьма перспективными носителями являются приготавливаемые на основе металлов и их оксидов, которые характеризуются высокой механической прочностью, относительной дешевизной, стабильностью и хорошими гидродинамическими свойствами.
Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объема. На практике для иммобилизации ферментов используют рутинные физические и химические методы. Все существующие методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединяется с носителем ковалентными связями) могут быть подразделены на четыре основные группы:
•адсорбция на поверхности нерастворимого носителя (или как иногда говорят матрикса);
•включение в поры геля;
•пространственное разделение фермента от остальной части реакционной смеси с помощью полупроницаемой мембраны;
85