выпускаются различными зарубежными фирмами и некоторые широко известны и у нас в стране, например "сефароза".
Агар – природный полисахарид, выделяемый из клеточных стенок некоторых морских водорослей. Точный состав его не известен, но установлено, что он содержит, по крайней мере, два полисахарида: агарозу и агаропектин. Преимуществом агара является его низкая стоимость и нетоксичность. Некоторые производные агара отличаются высокой механической прочностью и устойчивостью в щелочной среде, что явилось основанием рассматривать данный носитель почти идеальным.
Другими полисахаридами, получаемыми из морских водорослей, являются альгиновые кислоты и их соли, которые после некоторой модификации применяются для иммобилизации ферментов, клеток и клеточных органелл.
Гепарин – кислый полисахарид, успешно применяемый для получения водорастворимых препаратов иммобилизованных ферментов, используемых в медицине.
Синтетические полимерные носители
Огромное разнообразие синтетических полимеров обеспечивает их широкое использование в качестве носителей для иммобилизации ферментов. Синтетические полимеры используются для иммобилизации ферментов различными способами, а также для получения гелей и микрокапсул.
Полимеры на основе стирола
Полимеры этого типа являются основой для изготовления инообменных материалов, а также для изготовления микропористых и макропористых материалов, используемых в сорбционной иммобилизации.
Полимеры на основе производных акриловой кислоты
Одним из производных акриловой кислоты, широко применяемым в качестве носителя, является акриламид. Весьма широко применяется метод иммобилизации ферментов и клеток путем включения их в полиакриламидный гель (ПААГ). При этом процентное содержание полимера определяет пористость и жесткость геля. Некоторыми фирмами выпускаются носители смешанного типа, изготавливаемые па основе ПААГ и агарозы.
91
Полиамидные носители
Это группа различных полимеров с повторяющейся амидной группировкой. Главным достоинством носителей этого типа является то, что они могут быть созданы в различной физической форме: в виде гранул, порошков, волокон, мембран, трубок и т. п. Широкое применение таких носителей, особенно для медицинских целей, обусловлено и биологической инертностью, и стойкостью к воздействию биологических факторов.
В Европе для приготовления полусинтетического пенициллина используется на одном из этапов 6-амино-пенициллиновая кислота, получаемая с помощью иммобилизованного фермента пенициллинацилазы. В год производится примерно 3500 т этой кислоты, а для этого требуется произвести около 30 т указанного фермента.
Иммобилизованная глюкозоизомераза используется в США, Японии и Европе для промышленного производства концентрированного фруктозного сиропа путем частичной изомеризации глюкозы, получаемой из крахмала. Миллионы тонн такого сиропа ежегодно выпускаются с помощью этого фермента, который в настоящее время является наиболее широко применяемым из всех иммобилизованных ферментов.
Промышленные и коммерческие успехи этого процесса определяются следующими факторами: глюкоза, получаемая из крахмала, относительно дешевая; фруктоза – более сладкая, чем глюкоза; концентрированный фруктозный сироп содержит примерно одинаковые количества глюкозы и фруктозы, а по сладости подобен сахарозе.
Другой важной областью применения иммобилизованных ферментов является производство аминокислот с помощью аминоацилазы. Колонки с амино-ацилазой используются в Японии для производства сотен килограммов L-метионина, L-фенилаланина, L-триптофана и L-валина. Ферментно-полимерные коньюгаты широко используются в аналитической и клинической химии. Иммобилизованные на колонках ферменты могут использоваться повторно в качестве специфических катализаторов при определении различных субстратов. Например, разработаны ферментные электроды для потенциометрических и амперометрических определений таких веществ, как мочевина, аминокислоты, глюкоза, спирт и молочная кислота.
Электрод представляет собой электрохимический сенсор, находящийся в тесном контакте с тонкой проницаемой ферментной мембраной, способной специфически реагировать с какими-либо конкретными субстратами. Включенные в мембрану ферменты
92
продуцируют кислород, ионы водорода, ионы аммония, двуокись углерода или другие небольшие молекулы (в зависимости от осуществляемой реакции), которые затем легко детектируются специфическим сенсором. Выраженность ответа указывает на концентрацию определяемого вещества.
Применение ферментной технологии в существующих в настоящее время процессах (таких, как пивоварение, обработка пищевых продуктов, фармакология, химическая промышленность и т. п.) имеет огромные перспективы, однако до полной реализации ее еще весьма далеко.
Если говорить о будущем, то кажется вполне обоснованным ожидать, что производство и применение ферментов будут постоянно расширяться. Аргументацией этому является растущая в мире обеспокоенность в отношении загрязнения окружающей среды, истощения ряда ресурсов, в частности энергетических (рост цен на нефть и другие виды сырья). Все это стимулирует развитие новых направлений исследований, и практически не возникает сомнений, что ферменты в решении указанных проблем будут играть важную роль.
Наконец, несколько слов о так называемых иммобилизованных микробных клетках, которые получают все большее распространение и характеризуются снижением расхода времени и дорогих этапов очистки. Иммобилизация клеток достигается аналогичными методами, что и свободных ферментов. Огромным преимуществом иммобилизованных клеточных систем является замена ими сложных ферментационных процессов, таких, как получение вторичных продуктов микробного метаболизма (производство синтетических антибиотиков), в постоянно контролируемых химических процессах с использованием ферментных электродов, водных анализах и обработках отходов, непрерывных солодовых процессах, азотфиксации, синтезе стероидов и других медицинских продуктов.
93
8
Клеточная инженерия
Новый этап биотехнологии, интенсивно развивающийся в настоящее время, обусловил появление совершенно новых нетрадиционных объектов
– культивируемых тканей и клеток высших многоклеточных организмов, животных и растений, а также микроорганизмов, создаваемых методами генетической инженерии. В отличие от микроорганизмов культуры клеток высших организмов являются сравнительно новыми объектами, использование которых позволяет наладить производство ценных биологически активных веществ, вакцин и моноклональных антител.
Идея о возможности культивирования клеток вне организма впервые была высказана в конце прошлого столетия, но первые культуры клеток были получены в начале нашего века, и ими явились, как ни странно, клетки животных, а не растений. А культивирование растительных клеток на искусственных питательных средах долгое время не удавалось. И лишь в 30-е годы были достигнуты первые успехи в этой области, которые и обеспечили бурный расцвет данного направления.
Развитие метода культуры клеток растений приходится на 70-е годы, когда были разработаны методические приемы получения изолированных протопластов растительных клеток, а также метода гибридизации соматических клеток растений.
Культуры каллусных клеток
Основным типом культивируемых растительных клеток является каллусная, значительно реже культивируют клетки опухолевых тканей растений. Культуры опухолевых клеток при глубинном и поверхностном выращивании внешне и по морфологии клеток мало отличаются от культур каллусных клеток. Главным отличием опухолевых клеток является их гормональная независимость, что обеспечивает им рост на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Кроме того, опухолевые клетки лишены способности давать начало организованным структурам, таким, как корни или побеги в процессе органогенеза. Каллусные клетки в культуре могут спонтанно приобретать гормононезависимость, природа которой может быть следствием мутации или результатом экспрессии генов, определяющих независимость клетки от гормонов.
Каллусная клетка, при делении которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточной дифференциации,
94
свойственной высшему растению. В исключительных ситуациях у нормального растения может возникать каллусная ткань (обычно это случается при травмах), которая функционирует непродолжительное время, защищая растение в участке повреждения и накапливая питательные вещества для регенерационного процесса.
Для получения культивируемых каллусных клеток кусочки (фрагменты) тканей различных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду в пробирках, колбах или чашках Петри, строго соблюдая правила стерильности.
Особенности дедифференцирования (т. е. раздифференцировки) клеток экспланта и процесса каллусогенеза (т. е. образования каллуса) зависят от особенностей взятых для этого тканей. Клетки специализированных тканей растения (запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофила листа и т. п.) на питательной среде, содержащей источники углерода, минеральные соли, витамины и вещества гормонального типа, должны дедифференцироваться, т. е. потерять структуры, характерные для их специфических функций, которые они выполняют в растении, и вернуться к состоянию активно делящихся клеток.
Во всех случаях образование каллуса связано с травматическим воздействием, хотя каллусовые клетки могут возникать и в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза. В настоящее время техника культивирования растительных тканей настолько совершенна, что позволяет получить длительно перевиваемую каллусную культуру из любых живых тканей интактного растения.
Основными компонентами питательных сред для культуры тканей и клеток растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углерода (обычно сахароза или глюкоза), витамины и регуляторы роста. Иногда возникает необходимость добавления в среду различных комплексных соединений (таких, как гидролизат казеина, смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, различного рода растительные экстракты и т. п.). Как правило, при работе с новым объектом приходится эмпирическим путем подбирать оптимальные составы используемых питательных сред.
Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу, не имеющую определенной анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. По консистенции каллусные ткани также могут существенно различаться.
95