Преодоление защитных функций макрофагов факторами вирулентности Streptococcus pyogenes
Фрейдлин И.С., Старикова Э.А., Лебедева А.М. Институт экспериментальной медицины
Резюме
Обзор посвящен анализу молекулярных механизмов действия факторов вирулентности S. pyogenes, направленных на преодоление защитных функций макрофагов. Подробно описаны основные защитные функции макрофагов и механизмы их реализации в ходе развития стрептококковой инфекции. Рассмотрены факторы вирулентности S. pyogenes, препятствующие рекрутированию макрофагов в очаг инфекции. Особое внимание уделено анализу молекулярных механизмов подавления патогеном процесса фагоцитоза, внутриклеточной бактерицидности и продукции цитокинов макрофагами. Проведен анализ молекулярно-генетических механизмов регуляции экспрессии факторов вирулентности S. pyogenes, обеспечивающих адаптацию патогена к меняющимся условиям в очаге воспаления.
Ключевые слова: макрофаги, стрептококковая инфекция, S. pyogenes, фагоцитоз, бактерицидность.
Abstract
The review is devoted to the analysis of molecular mechanisms of action of S. pyogenes virulence factors aimed at overcoming the protective functions of macrophages. The review describes in detail the main protective functions of macrophages and the mechanisms of their implementation in the course of streptococcal infection. The virulence factors of S. pyogenes, which prevent the recruitment of macrophages to the site of infection, are examined. Particular attention is paid to the analysis of molecular effects that suppress the pathogen by the process of phagocytosis, intracellular bactericidal activity and the production of cytokines by macrophages. The analysis of molecular genetic mechanisms of regulation of the expression of S. pyogenes virulence factors that provide adaptation of the pathogen to changing conditions in the site of inflammation is carried out.
Key words: macrophages, streptococcal infection, S. pyogenes, phagocytosis, bactericidal activity.
Введение
Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) - стрептококк группы А (GAS), является патогеном исключительно для человека. Стрептококковые инфекции и вызываемые ими осложнения входят в первую десятку основных причин смертности от инфекций во всем мире. Ежегодно GAS вызывает 700 млн инфекций, в том числе 1,8 млн инвазивных. GAS в основном является возбудителем инфекций средней тяжести с поражением кожи и слизистых: фарингит, скарлатина, рожа, пиодермия (импетиго). Значительно реже стрептококковая инфекция приводит к тяжелым заболеваниям: сепсису, пневмонии, менингиту, синдрому токсического шока, некротизирующему фасцииту. Кроме того, доказана пусковая роль GAS в развитии аутоиммунных заболеваний: ревматической лихорадки, гломерулонефрита, реактивных артритов. S. pyogenes может оставаться в состоянии носительства. У 30% людей выявлена колонизация стрептококком носоглотки. С середины 1980-х гг. повысилось число случаев тяжелых системных стрептококковых инфекций, вызванных GAS серотипов M1 и M3. Выделение одних и тех же штаммов при инфекциях разной степени тяжести свидетельствует о зависимости тяжести инфекций и их исходов от полноценности механизмов защиты организма хозяина.
Пиогенные стрептококки относят к внекле- точно паразитирующим бактериям, высокая патогенность которых связана с быстрыми темпами размножения и с наличием множества факторов вирулентности, направленных на преодоление и нейтрализацию эффекторных функций клеток врожденного иммунитета организма-хозяина. Входными воротами инфекции GAS чаще всего служат эпителий слизистой носоглотки или кожа, что определяется тропностью стрептококков к этим тканям. Когда стрептококк преодолевает эпителиальный барьер, в субэпителиальной соединительной ткани он встречается с макрофагами (Мф), которые образуют первую линию защиты от патогена. Макрофаги экспрессируют широкий спектр рецепторов для распознавания консервативных структур бактерий (pathogen- associated molecular patterns, PAMP), что объясняет их способность инициировать воспаление и иммунный ответ. Эти клетки способны элиминировать патогены путем фагоцитоза и выполняют функцию антигенпрезентации при формировании адаптивного ответа на инфекцию [1].
Ведущая защитная роль макрофагов при стрептококковой инфекции была доказана в нескольких сериях экспериментов с искусственным удалением Мф из организма мышей. Удаление ССК2-положительных макрофагов с помощью дифтерийного токсина приводило к усилению диссеминации GAS и повышению летальности зараженных животных [2, 3]. Системная деплеция Мф с помощью хлордроната или использование трансгенных ССК2-дефектных мышей сильно повышали диссеминацию GAS в мягких тканях независимо от сохранности рекрутирования полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ). Повышенную диссеминацию GAS удавалось ревертировать при внутривенном введении моноцитов (Мн) или вну- трибрюшинном введении перитонеальных Мф. При моделировании у мышей недостаточности Мф каррагинаном или гадолиниум III хлоридом была выявлена следующая закономерность: мыши становились высокочувствительны к GAS в случае удаления Мф до заражения или в первые 24 ч после заражения [2]. У дефицитных по цитокину - фактору некроза опухоли альфа (TNFa) - мышей не происходило рекрутирования Мф в очаг инфекции, хотя инфильтрация ПЯЛ была не нарушена. Показана зависимость диссеминации GAS от TNFa, так как резидентные Мф нуждались в помощи Мн, рекрутированных при участии TNFa [4].
Во многом благодаря реализации эффекторно- го и регуляторного потенциала макрофагов, после преодоления эпителиального барьера стрептококки чаще всего подвергаются элиминации. Однако вирулентными штаммами стрептококков выработаны механизмы, позволяющие противодействовать макрофагам на всех этапах реализации их защитных функций: блокировать действие хемоаттрактантных факторов, ингибировать фагоцитоз или способствовать инвазии в клетки организ- ма-хозяина и внутриклеточному выживанию [1].
Способность GAS вызывать системные инфекции зависит от его устойчивости к факторам врожденного иммунитета, препятствующим его диссеминации, к которым относятся фагоцитирующие клетки: гранулоциты и макрофаги. При использовании биоинформационного анализа полного генома S. pyogenes были идентифицированы гены, ответственные за способность GAS нарушать процессы рекрутирования фагоцитов, ингибировать участие комплемента и антител в опсонизации, подавлять механизмы захвата бактерий, противостоять факторам бактерицидно- сти, регулировать апоптоз фагоцитов [5].
Препятствие рекрутированию макрофагов в очаг инфекции
При биопсии, взятой у пациентов с генерализованной инфекцией GAS, было показано присутствие содержащих GAS Мф в очаге инфекции. [2, 6]. Моноциты мигрируют в очаг инфекции по градиенту концентрации соответствующих хемоаттрактантов. Функции хемоаттрактантов могут выполнять компоненты и продукты деградации микроорганизмов, продукты деструкции тканей организма-хозяина, активированная фракция комплемента С5а или молекулы цитокинов семейства хемокинов, в первую очередь IL8. Патогенные GAS обладают факторами вирулентности, разрушающими отдельные хемоаттрактанты или угнетающими их активность. Стрептококковые мембран-связанные протеолитические ферменты С5а-пептидаза (ScpA) и сериновая протеаза (SpyCEP) инактивируют компонент комплемента С5а, препятствуя хемотаксису и рекрутированию клеток в очаг инфекции. Мутация гена, контролирующего экспрессию С5а-пептидазы, повышает темпы очищения организма зараженных подкожно мышей от стрептококка [7]. Кроме того, GAS экспрессируют поверхностно-ассоциированный С5а-связывающий протеин (C5aBP), способный разрушать С5а компонент системы комплемента [8]. Стрептококковая сериновая протеаза SpyCEP катализирует расщепление и инактивацию хемо- кинов IL-8, КС, MIP-2 [5].
Вмешательство в механизмы фагоцитоза макрофагов
Рецепторы макрофагов, участвующие в фагоцитозе, принято делить на опсонические (CR - рецепторы белков комплемента и FcR - рецепторы Fc-фрагментов молекул иммуноглобулинов) и не- опсонические, которые связываются непосредственно с лигандами в составе бактерий. К неопсо- ническим относятся: семейство паттерн-распоз- нающих рецепторов (pattern recognition receptors, PRR), лектины, маннозные рецепторы (MR), рецепторы Р-глюкана (дектин-1), SR-A, MARCO. PRR, в том числе toll-lake receptors (TLR), распознают и связывают бактериальные патоген-ас- социированные молекулярные паттерны (PAMP), к которым относятся компоненты клеточной стенки стрептококка (липопротеины, липопепти- ды, пептидогликаны, липотейхоевая кислота), являющиеся лигандами TLR2.
Когда TLR2 связывают PAMP стрептококков, активируются факторы транскрипции nuclear factor-kappa B (NFkB) и семейства IRF. Передача сигнала от TLR в клетку осуществляется, преимущественно, через сигнальный адаптер myeloid differentiation factor 88 (MyD88). Показана необходимость MyD88 для запуска воспалительного ответа на GAS. При дефиците MyD88 у фагоцитирующих клеток драматически снижена продукция фактора некроза опухоли (TNF), интерлейкина (IL) 6, IL-12, интерферона (IFN) типа I. MyD88 опосредует рекрутирование Мф в очаг и предупреждает инвазирование бактерий [9]. В распознавании PAMP стрептококка важную роль играют внутриклеточные паттерн-распознающие рецепторы - NOD-подобные рецепторы (NLRs). Пептидоглика- ны клеточной стенки бактерий являются лигандами поверхностных TLR2, однако после захвата бактерий в цитоплазме Мф от пептидогликанов отщепляется мурамилдипептид (MDP), который связывается с nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 (NOD2), что является дополнительным фактором активации инфламмасом [10].
PRRs играют главную роль в распознавании бактерий, индукции провоспалительного сигнала и продукции цитокинов, но не участвуют непосредственно в фагоцитозе. Фагоцитарными рецепторами служат опсонические рецепторы CR и FcR, а из неопсонических - MR и SR-A. Мф экспрессируют полный набор Fcy-рецепторов - FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16) и рецепторы для компонентов комплемента, которые распознают фрагменты СЗЬ и C3d - CR1 (CD35), CR3 (CD11b/CD18, или Мас-1) и CR4 (CD11c/ CD18, или р150,95). CR3 связываются с C3-лигандами, образующимися при активации системы комплемента, и опосредуют миграцию и фагоцитоз. Связывание с FcR опсонизирующих антител ведет к активации внутриклеточных тирозин-киназ, индукции респираторного взрыва и продукции метаболитов арахидоновой кислоты.
Антифагоцитарную защиту стрептококка обеспечивает капсула, которая состоит из полимеров высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (HA) или гиалурона и N-ацетилглюкозамина. Капсула является одним из факторов адгезии и инвазии стрептококка и создает физический барьер, препятствующий доступу фагоцитов к бактериальным клеткам. Нативная капсульная гиалуроновая кислота ингибирует захват бактерий Мф и повышает выживаемость GAS в организме мышей. Частичная деградация HA стрептококковой гиалуронидазой повышала захват GAS Мф in vitro и лимитировала развитие инфекции у мышей [8]. При инфекции высокомолекулярная HA превращается в низкомолекулярные продукты деградации, которые в отличие от нативной высокомолекулярной гиалу- роновой кислоты не снижают захват GAS Мф и не повышают их выживания в крови. Поэтому генерация короткоцепочечных фрагментов HA может играть протективную роль при инфекции [11].
Компоненты клеточной поверхности стрептококков, такие как М- и Т-протеины, связывающие фибронектин, ламинин, могут препятствовать захвату бактерий. GAS использует различные белки матрикса (фибронектин, коллаген) для формирования крупных агрегатов, превосходящих размеры, доступные для фагоцитоза. Секретируемый
GAS мультифункциональный белок SIC нарушает биофизические процессы, необходимые для фагоцитоза [8]. Проведенное исследование in vitro показало, что белок М111 S. pyogenes обладает антифагоцитарными свойствами [12].
На поверхности стрептококка экспрессирован фермент энолаза, участвующий в связывании плазмина. Другим белком, связывающим плаз- мин, является секретируемая стрептококками стрептокиназа (Ska), обладающая фибринолитическими свойствами. Протеаза Ska превращает плазминоген в плазмин, который откладывается на поверхности GAS, препятствует фагоцитозу и способствует диссеминации бактерий [8].
Фибронектин и другие белки на поверхности стрептококка препятствуют связыванию CR3 и FcR с их лигандами. Система комплемента имеет механизм саморегуляции: белок C4BP и фактор FH для ограничения активации комплемента. GAS обладает способностью связывать эти белки и препятствовать опсонофагоцитозу. Фибриллярный поверхностный белок GAS М-протеин связывается с C4BP и FH-фактором H, что препятствует отложению C3b на поверхности бактерий. М-протеин, связывая фибриноген, снижает активность C3-к:онвертазы при классическом пути активации комплемента [7]. GAS имеет несколько поверхностных белков, способных связывать фи- бронектин FBPs, которые способствуют избеганию фагоцитоза GAS путем ингибиции активности комплемента. М1-серотип GAS секретирует протеиновый сывороточный ингибитор SIC, угнетающий комплемент-опосредованный лизис бактерий и участвующий в обеспечении резистентности к фагоцитозу [4]. Молекула CD46, которая экспрессирована на поверхности моноцитов, принадлежит к семейству регуляторов активности комплемента и инактивирует белки СЗЬ и C4b системы комплемента. М-протеин GAS способен связываться с CD46 на поверхности клеток, препятствуя опсонофагоцитозу [7].
Сигналинг от CR3 менее эффективен по сравнению с FcR в индукции респираторного взрыва при фагоцитозе. FcR-опосредованный захват бактерий ведет к их транспорту в фагосомы с последующим слиянием с лизосомами, гибелью и разрушением бактерий. Это позволяет считать взаимодействие иммуноглобулинов с FcR наиболее эффективным вариантом опсонизации. GAS использует разные пути препятствия этому варианту опсонизации. GAS продуцирует эндопептидазу immunoglobulin G-degrading enzyme (IdeS) - фермент, специфичный к области hinge молекулы иммуноглобулина (Ig) G, способный интерферировать с эффекторными функциями IgG, в частности с опсонизацией для фагоциоза [13]. Продуцируемые бактериями фибронектин-связывающие белки, разные типы М-протеина, H-протеин связываются с Fc-областью Ig, препятствуя опсо- нофагоцитозу Мф. Протеазы цистеина Mac-1/ Ides способны разрушать все изотипы Ig in vitro. Мас2-протеин обладает способностью связываться с FcRII и FcRIII, ингибируя распознавание Ig на поверхности бактерий. Как и Mac-1/Ides, Mac2 проявляет эндопептидазную активность. Секретируемый стрептококками белок EndoS гидролизует гликан в молекуле Ig, препятствуя его распознаванию Fc-рецепторами макрофагов, блокируя классический путь активации комплемента и опсонофагоцитарную реакцию [5].