Недавно было показано, что стрептококковый пирогенный экзотоксин B (Streptococcal pyrogenic exotoxin B, SpeB) является цистеин-протеиназой, препятствующей фагоцитозу за счет протеолитической активности и способности разрушать: гликопротеины матрикса (FN, витронектин, ламинин), IL-1, хемокины, иммуноглобулины, компоненты комплемента и плазминоген организма хозяина, участвующие в опсонизации бактерий. SpeB-дефектные мутанты легче фагоцитировались, а GAS дикого штамма эффективно разрушали C3b [8].
Механизмы внутриклеточного выживания S. pyogenes в макрофагах
Представление о GAS как о внеклеточно паразитирующей бактерии в настоящее время пересматривается в связи с новыми экспериментальными данными. Показана способность GAS выходить из фагосом в цитоплазму Мф, где они находят более подходящие условия для выживания [5]. Возможность пролиферации S. pyogenes в живых человеческих макрофагах на уровне клеточной популяции и на уровне отдельных клеток убедительно доказана в исследовании O'Neill и соавт. [14], в котором показано, что для активной внутриклеточной пролиферации стрептококков важным условием является их выход из фагосом в цитозоль.
Наиболее вирулентные штаммы стрептококка могут длительно выживать внутри макрофагов, которые при этом обеспечивают их защиту от других иммунных механизмов и от действия антибиотиков. Неоднократно выявляли живые S. pyogenes в макрофагах из биоптатов пораженных тканей от больных инвазивной инфекцией [6, 15]. Показана способность S. pyogenes выходить из Мф с последующим инфицированием других клеток, т. е. МФ могут служить резервуаром диссеминации и продолжения повреждения тканей [15].
Для вирулентных штаммов S. pyogenes описано несколько механизмов устойчивости к гибели внутри макрофагов. Экспрессированный на поверхности бактерий М-протеин служит важным фактором, подавляющим созревание фагосом и выживание S. pyogenes в Мф человека [15]. Внутриклеточное выживание S. pyogenes связано с М-протеин-зависимым нарушением внутриклеточного движения по пути «фагосома - лизосома». Показано участие белка М1 в механизме избегания слияния фагосом, содержащих S. pyogenes, с лизосомами макрофагов [16]. Фагоцитарная вакуоль, содержащая экспрессирующие M1 протеин S. pyogenes, служит для бактерий нишей выживания и репликации. Нарушение созревания фаголизо- сом может ограничивать контакт с кислородными радикалами и индукцию окислительного взрыва. Пиогенные стрептококки экспрессируют глутатион пероксидазу GpoA, мощный антиоксидантный фактор, позволяющий им адаптироваться к окси- дативному стрессу в фаголизосомах [5].
Установлено, что гемолитический экзотоксин стрептолизин О (SLO) ингибирует транспорт бактериальных клеток в фагосомы и облегчает их выход из фагосом в цитозоль [4]. SLO генетически и функционально связан с другим фактором вирулентности стрептококка - NAD-гликогидролазой (NADase), которая является котоксином SLO [4]. Дефицитные по NADase штаммы стрептококков отличаются более низкой вирулентностью в мышиных моделях [17]. Продукция фагоцитированными стрептококками SLO приводит к формированию пор в мембранах фаголизосом, что способствует транслокации NADase в цитозоль МФ. NADase участвует в подавлении созревания фагосом, ин- гибиции ацидификации фаголизосом и транспорта фагоцитированных бактерий в лизосомы [17, 18].
Подавление механизмов бактерицидности макрофагов
Судьба фагоцитированных бактерий зависит от процесса слияния лизосом с фагосомой, который обеспечивает целенаправленное попадание факторов микробицидности непосредственно в фагосому без повреждения цитоплазматических структур клетки. В благоприятном случае фагоцитированные бактерии погибают через 30-60 мин после захвата под действием факторов микро- бицидности, к которым относятся образующиеся в ходе респираторного взрыва активные формы кислорода, оксид азота (NO), бактерицидные ферменты (миелопероксидаза, лизоцим), нейтральные протеиназы (эластаза, катепсин G, протеиназа-3), кислые гидролазы (N-ацетил-Р- глюкозаминидаза, катепсин В, катепсин D, Р-глю- куронидаза, Р-глицерофосфатаза, а-маннозида- за), арилсульфатаза, а также кислые гликоза- миногликаны (мукополисахариды). Выживание и длительная персистенция патогена в клетках ор- ганизма-хозяина возможны при мобилизации патогенными стрептококками разных механизмов подавления факторов микробицидности.
Пиогенные стрептококки, как все молочнокислые бактерии, используют гликолиз для получения энергии и продуцируют лактат как конечный продукт метаболизма. Поэтому закисление окружающей среды является естественным следствием роста этих микроорганизмов [19]. Одним из механизмов, позволяющих стрептококкам адаптироваться к кислотному стрессу, является продукция аммиака и аденозин-трифосфата в реакции гидролиза аргинина, который осуществляет система ферментов аргининдеиминазы (АД) [20]. АД является одним из трех ферментов, осуществляющих конверсию аргинина в орнитин, аммиак и CO2, с параллельной продукцией ATP. Это помогает бактериям преодолевать дефицит кислорода, питательных веществ и выживать в разных биологических нишах [21, 22].
В ряде исследований показано, что АД играет существенную роль для инвазирования и выживания S. pyogenes в эпителиальных клетках человека. Так, установлено, что мутантный штамм S. pyogenes с делецией гена АД (arcA) обладает сниженной способностью к инвазии и внутриклеточному росту по сравнению с исходным штаммом [23]. Исследования in vitro на культурах Hep-2C и A549 показали, что мутантный штамм, не экспрессирующий АД, примерно в 3-5 раз слабее инвазировал эпителиальные клетки по сравнению с исходным штаммом. Оба исследуемых штамма S. pyogenes, исходный и мутантный, были одинаково чувствительны к низкому pH. Однако аргинин в концентрации 1 мМ достоверно повышал выживаемость в кислой среде только исходного штамма [23, 24].
Несмотря на активные исследования, точные механизмы, благодаря которым АД способствует внутриклеточному выживанию и даже репликации бактерий, до сих пор не ясны [25]. Вероятно, АД препятствует закислению среды в фагосоме благодаря продукции аммиака. Это не только защищает бактерии от потенциально летального действия низких показателей pH, но и препятствует слиянию фагосомы с лизосомой [20, 26]. Нельзя исключать, что АТФ, продуцируемый в рамках системы ферментов АД, служит источником энергии для FlFO-АТРзы, которая поддерживает цитоплазматический кислотно-щелочной баланс за счет активного транспорта протонов из клетки [20, 27].
Среди факторов микробицидности Мф важное место занимает NO. В организме млекопитающих единственным субстратом для генерации NO при участии NO-синтазы (NOS) является аргинин [28], поэтому биодоступность этой аминокислоты является фактором, ограничивающим продукцию NO [29]. За счет деплеции аргинина фермент АД может улучшать условия выживания бактерий в фаголизо- сомах [25]. В пользу этой гипотезы говорят данные, полученные в наших исследованиях с использованием продуктов ультразвукового разрушения двух штаммов: исходного S. pyogenes М49-16 и мутантного S. pyogenes M49-16 delArcA с инактивированным геном АД (arcA). В этих экспериментах показано, что способность стрептококков ингибировать продукцию макрофагами NO зависит от наличия у них аргининдеиминазной активности.
Исходный штамм, экспрессирующий АД и обладающий способностью гидролизовать аргинин из среды, подавлял индуцированную ЛПС продукцию NO макрофагами линии J774. В отличие от этого мутантный штамм S. pyogenes M49-16 delArcA подобным действием не обладал. При добавлении в среду избытка аргинина, ингибирующего продукцию NO, действие исходного штамма S. pyogenes М49-16 нивелировалось, что явилось дополнительным доказательством зависимости синтеза NO макрофагами от биодоступности субстрата для индуцированной NOS [30].
Продукция цитокинов макрофагами
Распознавание стрептококковых PAMPs с участием TLRs макрофагов ведет к рекрутированию лейкоцитов и усиленной продукции ими провос- палительных цитокинов. Взаимодействие GAS с TLR-2 макрофага запускает каскад внутриклеточных сигналов, ответственных за активацию транскрипционных систем: NF-kB, IRFs и MAPK.
S. pyogenes влияет на экспрессию цитокинов с помощью прямой активации транскрипционного фактора NF-kB или опосредованно через активацию белков STAT.
При распознавании PAMP стрептококка активируются продукция и секреция Мф провос- палительных цитокинов: IL-1, TNFa и хемокинов IL-8, macrophage inflammatory protein (MIP) 2, MIP-1a, monocyte chemoattractant protein (MCP). Первоначально секретируются хемокины, ответственные за рекрутирование нейтрофилов [31]. Продукты разрушения молекулы пептидоглика- на распознаются NOD-белками и вовлекаются в активацию транскрипционного фактора NF-kB. Кроме того, NOD-белки регулируют цистеин-протеазу - каспазу-1, активация которой ведет к усилению продукции провоспалительного цитокина IL-1Я. IL-1Я продуцируется в виде неактивной проформы pro-IL-1, которая затем деградирует с генерацией зрелой формы IL-1 [32]. Созревание IL-1 под влиянием цистеин-протеазы каспазы-1 связано c активацией NALP3-зависимых цитозольных мультибелковые комплексов, получивших название «инфламмасомы». Кроме каспазы-1 инфламмасомы содержат «протеин-сенсор» Nlrp3, который может быть активирован разными стимулами, включая стрептококковый SLO в GAS-сти- мулированных Мф. Nlrp3 mRNA экспрессируется в Мф конститутивно, а в первые 3 ч после заражения GAS происходит четырехкратное повышение экспрессии гена Nlrp3 [10]. Одновременно пиогенные стрептококки могут продуцировать факторы вирулентности, ингибирующие активацию инфламмасом и созревание IL-1Я. Показано, что стрептококковая NADase снижает инфламма- сом-зависимую секрецию IL-1 инфицированными Мф, что представляет один из механизмов избегания стрептококком иммунной защиты [17].
При использовании биоинформационного анализа полного генома S. pyogenes идентифицирован новый фактор вирулентности, названный «5-нукле- отидаза А» (S5nA). Внеклеточная S5nA осуществляет конверсию AMP в аденозин, который подавляет иммунный ответ за счет ингибиции синтеза макрофагами провоспалительных цитокинов [33].
Регуляция экспрессии факторов вирулентности GAS в ходе развития инфекции
Способность S. pyogenes выживать в жестких условиях микроокружения организма-хозяина определяется наличием у этих бактерий специальных сенсоров, которые призваны регулировать экспрессию факторов вирулентности в постоянно меняющихся условиях развития инфекции. У пиогенного стрептококка адаптивный ответ на сигналы от микроокружения организма-хозяина регулируется сложной сетью глобальных транскрипционных регуляторов. К ним относятся: двухкомпонентный сенсор-регулятор, отдельно стоящие регуляторы ответа и альтернативные сигма-факторы, кодирующие двухкомпонентную регуляторную систему (TCS). У S. pyogenes обнаружено 13 разных генов TCSs, из которых изучены более подробно гены регуляторов: CowR/S, FasBCAX, SptR/S и Ink/Irr. Двухкомпонентный глобальный транскрипционный регулятор CowR/S, который контролирует 15% генома S. pyogenes, охарактеризован как репрессор транскрипции факторов вирулентности гиалуро- новой капсулы, цистеин-протеазы SpeB, цитотоксина SLS, стрептокиназы, стрептолизинов O и S, цистеин-протеазы Mac/ldeS. В раннюю фазу инфекции наблюдали выраженное стимулирующее действие генов ink, irr, которые контролируют 20% генома GAS, в том числе синтез пептидогли- канов клеточной стенки и факторов, поддерживающих выживание бактерий в Мф. Активация регулятора Ink/Irr при одновременной ингиби- ции негативного транскрипционного регулятора CowR/S ведет к усилению экспрессии нескольких факторов вирулентности: SLS, SIC, ДНКазы, М-протеина, Il-8 протеазы, SodA, гиалуроно- вой капсулы. При этом активируются факторы, блокирующие фагоцитоз и повышающие устойчивость GAS к бактерицидному действию Мф. Мутации генов факторов вирулентности и генов глобальных транскрипционных регуляторов в процессе взаимодействия бактерий с Мф могут приводить к сдвигам бактериального генотипа в направлении усиления инвазивности. Это считают одной из причин перехода бактерионосительства в развитие инвазивной стрептококковой инфекции [5].
С использованием современных методов молекулярной биологии удалось показать, что в ходе развития инфекции и взаимодействия GAS с Мф геном бактерий претерпевает значительные изменения в направлении повышения экспрессии факторов вирулентности [34]. Через 2 ч после инфицирования выявлены изменения генома и протеома S. pyogenes по сравнению с внеклеточными бактериями. Во внутриклеточном окружении значительно изменилась экспрессия 145 генов стрептококка, контролирующих метаболические и энергозависимые процессы. В раннюю внутриклеточную фазу происходило повышение экспрессии генов ink и irr. Экспрессия генов, ответственных за индукцию окислительного взрыва в Мф, в первые 2 ч была снижена. Через 6 ч повышалась экспрессии генов, ответственных за продукцию М-протеина как фактора выживания стрептококков в Мф [35].
Наиболее ярким примером фазовых изменений факторов вирулентности GAS в динамике стрептококковой инфекции и взаимодействия с Мф являются изменения экспрессии цистеин-протеазы SpeB стрептококка. SpeB, наряду с протеолитиче- кой деградацией многих белков организма-хозяина, оказалась способна разрушать большинство белков, секретируемых GAS, включая факторы вирулентности: М-протеин, стрептокиназу, SpeF, Sda1, C5a пептидазу, секретируемый ингибитор комплемента. Поэтому повышенная экспрессия SpeB приводит к снижению вирулентности бактерий. Разрушая собственный поверхностный М-протеин стрептококка, SpeB повышает чувствительность бактерий к фагоцитозу. В клиникоэпидемиологических исследованиях обнаружена обратная корреляция между тяжестью инфекции M1T1 GAS и экспрессией стрептококковой SpeB. Исследование биоптатов пораженных тканей при инвазивных стрептококковых инфекциях выявило наряду с Мф, содержащими живые стрептококки, повышенное количество SpeB [6]. У инвазивных штаммов GAS экспрессию SpeB регулирует зависимый от фазы роста бактерий фермент эндопептидаза PepO, которая влияет на экспрессию гена speB и вирулентность стрептококка [36].
Защитные факторы организма-хозяина оказывают давление на патоген в направлении селекции штаммов, приобретающих новые гены или сохраняющих ключевые факторы вирулентности, необходимые для выживания в определенных нишах организма. В частности, в организме идет преимущественная селекция SpeB-отрицательных бактерий или обеспечивается подавление активности SpeB для поддержания сохранности факторов вирулентности S. pyogenes. Ингибиция экспрессии SpeB обеспечивает оптимальные условия в нишах организма для персистенции бактерий с сохранением их полного арсенала факторов вирулентности и повышением их патогенного потенциала [37]. Через 60-80 ч после инфицирования стрептококки поселяются в нишах внутренней среды организма (в том числе в макрофагах), которые предназначены для выживания и размножения бактерий и где происходит селекция более подходящих мутантов, лучше защищенных от факторов иммунитета. Наиболее подходящими оказываются мутанты, лишенные экспрессии SpeB [38]. При моделировании инфекции введением штамма SpeB+/SpeA- M1T1 GAS в подкожную камеру мышам обнаружили изменение протеома бактерий: стабильный фазовый сдвиг в сторону фенотипа SpeB-/SpeA+, экспресирующего и секретирующего полный набор факторов вирулентности. Протеом этого фенотипа SpeB-, приобретенный in vivo, не отличался от протеома изогенного мутанта с делецией гена speB. Другим примером может служить спонтанная мутация в опероне CowR/S, приводящая к утрате экспрессии SpeB и к усилению транскрипции генов нескольких факторов вирулентности GAS с развитием системной GAS-инфекции [39]. Таким образом, при стрептококковой инфекции осуществляется регуляция экспрессии факторов вирулентности патогена.