Материал: Принципы и основные методы генетической инженерии. (110

дукты амплификации в этом случае не образуются. Продукты RAPD-ПЦР представляют собой анонимную последовательность ДНК, заключенную между двумя инвертированными повторами, разной длины. Их выявляют гель-электрофорезом (как присутствие или отсутствие отдельной RAPDполосы). RAPD-маркеры являются высокоинформативной характеристикой для оценки генетического разнообразия и родства. Типичная схема метода RAPD-ПЦР представлена на рис. 11.

Для некоторых RAPD-маркеров установлена связь с генами устойчивости к заболеваниям. На сельскохозяйственных растениях показана возможность использования RAPD-маркеров в селекции на гетерозис: для оценки генетического разнообразия исходных инбредных линий и подбора родительских пар для создания высокогетерозисных гибридов и др. Одним из недостатков RAPD-маркеров является их доминантное (а не кодоминантное) наследование. Считают, что в F2 доминантные маркеры дают в 2 раза меньше информации, чем кодоминантные. Эти недостатки RAPDмаркеров преодолевают с помощью методов, занимающих промежуточное положение между ПДРФ- ПЦР-анализом. Среди них особый интерес представляют AFLP-маркеры.

31

Рис. 11. Схема RAPD-ПЦР

32

5.2. Поиск гомологичных генов

Во всех живых организмах протекают сходные биохимические процессы, катализируемые ферментами, которые ускоряют идентичные химические реакции. Например, как у растений, так и у животных функционирует цикл трикарбоновых кислот, реакции которого катализируют ферменты. Структура этих ферментов у разных организмов может различаться, однако выполняемые ими функции сходны. Такие ферменты, играющие одинаковую роль в метаболизме разных организмов, называют гомологичными. Аналогичное название имеют гены, кодирующие эти ферменты.

Несмотря на то, что структура гомологичных белков может варьироваться, они имеют высококонсервативные участки, входящие в состав каталитических центров. По аналогии с белками существуют консервативные последовательности и в генах.

Если создать праймеры, комплементарные таким консервативным последовательностям, то с помощью ПЦР можно найти гомологичный ген в организме, в котором наличие этого гена неизвестно.

В случае если гомологичный ген в исследуемом организме действительно существует, происходит отжиг праймеров на молекуле ДНК организма. Затем этот участок ДНК, фланкированный (ограниченный) праймерами, амплифицируется. Так, выделив какой-то ген, скажем, из мыши, можно узнать, есть ли подобный ген, а, следовательно, фермент и биохимическая реакция у человека.

Технология ПЦР используется также для определения нуклеотидных последовательностей исследуемых генов).

5.3. Идентификация маркерных генов

Каждый организм имеет уникальные, свойственные только ему гены или другие участки ДНК. Такие последовательности являются маркерными для организма. Если определить наличие маркерного участка, то можно однозначно диагностировать организм. ПЦР позволяет идентифицировать такие маркерные участки генома. В основе лежит все тот же принцип комплементарности праймеров маркерным фрагментам. Если ПЦР имеет положительный результат, значит, маркеры идентифицированы. Следовательно, определен и вид организма.

Этот факт имеет огромное значение в медицинской диагностике. Именно поэтому только в США в 1996 году на ДНК-диагностику было потрачено 181,6 млн долларов. А к 2003 году рост спроса на этот метод прогнозируют до 1400,0 млн.

33

5.4. Применение ПЦР в медицинской диагностике

Полимеразная цепная реакция позволяет оперативно поставить диагноз многих заболеваний. По данным журнала LabMedica прогнозируется развитие пяти основных направлений генодиагностики:

1)диагностика инфекционных заболеваний;

2)диагностика онкологических заболеваний:

–диагностика лейкемий и лимфом;

–диагностика рака груди;

–диагностика других злокачественных заболеваний;

3)диагностика генетических заболеваний;

4)идентификация личности:

–судебная медицина, криминалистика;

–трансплантация органов и тканей;

–определение отцовства;

5)диагностика патогенов в пище.

Главным направлением развития рынка ДНК-диагностики является диагностика инфекционных заболеваний. Если человек страдает заболеванием бактериального или вирусного происхождения, то в его крови обязательно находятся возбудители – бактериальные или вирусные частицы. Любой возбудитель несет маркерные последовательности ДНК, для которых можно сконструировать праймеры. Таким образом, с помощью ПЦР можно определить присутствие того или иного микроорганизма в крови, т.е. поставить диагноз.

В отличие от иммуноферментного анализа, который широко используется для диагностики инфекционных заболеваний, ДНК-диагностика позволяет определять непосредственно возбудителя заболевания, причем в очень низкой концентрации.

Вот лишь некоторые инфекционные заболевания, которые в настоящее время диагностируются с помощью полимеразной цепной реакции.

34

Диагностика рака пока ограничивается небольшим количеством сведений о генах, ассоциированных с этим заболеванием. Для развития успешных методов определения рака необходимы дальнейшие исследования мутаций (в т.ч. в рамках программы «Геном человека»), связанных с канцерогенезом. Вообще название «рак» объединяет большое количество разных заболеваний. В каждом конкретном случае, как правило, неизвестна мутация, приведшая к новообразованию, что существенно затрудняет его диагностику.

Диагностика генетических заболеваний, также как и раковых, может развиваться только вслед за проведением широких научных исследований генома человека. Однако уже сейчас известны гены некоторых генетических заболеваний, например, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона. Гены подобных заболеваний обычно начинают работать в возрасте после 70 лет. Поэтому их ранняя диагностика позволит заранее начать лечение, которое в этом случае может быть более эффективным.

Идентификация личности – одно из самых перспективных направлений на рынке ДНК-диагностикумов. Это очень быстрый и точный метод. Ежегодный прирост в этом секторе ожидается на 21,3 %.

Сектор рынка ДНК-диагностики патогенов в пище в настоящее время является самым скромным. В настоящее время на ДНК-диагностику микробного загрязнения производимых продуктов питания приходится менее 5 % от общего количества способов, применяемых для тестирования загрязненности продуктов. Однако методы ДНК-диагностики являются, по оценкам экспертов, более быстрыми, точными и информативными, что в ближайшее время приведет к резкому возрастанию доли данного сектора рынка ДНК-диагностики.

35