ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
ПРИНЦИПЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Учебное пособие
Составители: В.Н. Попов, О.С. Машкина
Издательско-полиграфический центр Воронежскогогосударственногоуниверситета
2009
Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 3 сентября 2009 г., протокол № 1
Рецензент д-р биол. наук, проф. А.Т. Епринцев
Учебное пособие подготовлено на кафедре генетики, цитологии и биоинженерии биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.
Рекомендуется для студентов дневного и вечернего отделения биологопочвенного факультета.
Для специальности 020201 – Биология
2
СОДЕРЖАНИЕ
Введение …………………………………………………………………………4
1.Рестриктазы – основные ферменты генетической инженерии ……………5
2.Этапы создания трансгенных организмов. Векторная
трансформация. …………………………………………………………………6
2.1.Понятие о векторе. Типы векторов, их конструирование …………...7
2.2.Методы переноса генов в клетки различных организмов ………….14
2.3.Клонирование генов …………………………………………………..15
3.Создание и скрининг банка генов …………………………………………16
3.1.Принципы создания банка генов …………………………………….16
3.2.Выбор нужного гена из клонотеки (скрининг банка генов).
Блот-гибридизация ………………………………………………………...18
4.Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) …………………………………………………………………24
4.1.Принципы ПЦР ……………………………………………………….24
4.2.Визуализация и учет результатов реакции ………………………….27
4.3.Полимеразная цепная реакция в реальном времени ………………..28
5.Области применения и примеры использования ПЦР …………………...28
5.1.Диагностические технологии на базе ПЦР …………………………28
5.2.Поиск гомологичных генов …………………………………………..33
5.3.Идентификация маркерных генов …………………………………...33
5.4.Применение ПЦР в медицинской диагностике ……………………..34
Рекомендуемая литература …………………………………………………...36
3
ВВЕДЕНИЕ
Генетическая инженерия – перспективное направление современной генетики, имеющее большое научное и практическое значение и лежащее в основе современной биотехнологии.
Любой ген и продукты его экспрессии (РНК и белки) стали доступны для исследования структуры и функций; появилась возможность исследовать гигантские геномы высших организмов и целенаправленно изменять их структуру. В практическом отношении стало возможным направленное создание организмов с новыми (в том числе не встречающимися в природе) комбинациями наследственных свойств, что трудно (или невозможно) сделать обычными методами – гибридизацией, мутагенезом и др. Основными задачами, стоящими перед генетической инженерией сегодня, являются борьба с болезнями и производство продовольствия. Методы генетической инженерии стали незаменимыми в фармакологии. Они позволили получать ценные лекарственные препараты, используя живые организмы в качестве биореакторов. Генно-инженерные методы находят все более широкое применение в медицине, став основой генотерапии (лечения генами), позволившей излечивать многие ранее неизлечимые наследственные заболевания.
В работах по генетической инженерии используются как методы классической генетики, так и самые современные более тонкие методы молекулярной генетики (такие как выделение и идентификация генов, их секвенирование, картирование, химический и ферментативный синтез, ПЦРанализ, блот-гибридизация, генный нокаут, генная дактилоскопия и др.). В пособии дается подробное описание некоторых из них.
Генетическая инженерия, как известно, – высокотехнологичный процесс, основанный на фундаментальных научных знаниях и требующий высококвалифицированных кадров и мощной научно-технической базы. Поэтому будущим специалистам в качестве основы для проведения исследований по генетической инженерии необходимо иметь представление об основных этапах создания трансгенных организмов, принципах конструирования рекДНК, знать процедуры по созданию и скринингу банков генов как источников для получения и изучения функций желаемых для переноса генов и др. С этими вопросами они могут ознакомиться в данном пособии.
Исследования по генной инженерии проводятся в научных лабораториях и крупных фирмах в нашей стране и за рубежом достаточно широко, поэтому специалисты в этой области являются востребованными. Это послужило основанием для выделения темы по генетической инженерии в отдельную, чтобы студенты имели возможность самостоятельно подробнее и глубже ознакомиться с ней.
При написании пособия была использована новейшая литература по теме, в том числе и та, что мало доступна широкому кругу читателей. Посо-
4
бие может быть использовано студентами всех форм обучения по курсу «Молекулярная генетика с основами генной инженерии».
Генетическая (геннная) инженерия – это методы получения реком-
бинантных (гибридных) ДНК из фрагментов геномов разных организмов, введение их в клетку и обеспечение условий для экспрессии чужеродных генов. При этом можно осуществить направленное конструирование (создание) организмов с заданными (нужными человеку) свойствами, что трудно (или невозможно) сделать обычными методами – гибридизацией, мутагенезом и др.
Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 г., когда группа П. Берга в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК (рекДНК), объединившую в своем составе генетический материал из трех источников: полный геном онкогенного вируса обезьян SV40, часть генома умеренного бактериофага λ и гены лактозного оперона E. сoli. Сконструированная рекомбинантная молекула не была исследована функционально, т.к. у авторов этой работы возникли опасения, что методы генетической инженерии могут привести к возникновению микроорганизмов, опасных для здоровья человека, например, бактерий Е. сoli, способных перенести онкогенные вирусы в кишечник человека. Поэтому международным научным сообществом было принято решение проводить такие исследования под строжайшим контролем со стороны государства.
1. РЕСТРИКТАЗЫ – ОСНОВНЫЕ ФЕРМЕНТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ
В основе методов генной инженерии лежит способность бактериальных ферментов рестрикции (рестриктаз) расщеплять ДНК на отдельные довольно короткие нуклеотидные последовательности. Естественной функцией рестриктаз является защита бактерии от инфекции вирусами. Эти ферменты рестрицируют (т.е. ограничивают) возможность размножения фаговой ДНК в бактерии путем разрезания ее на части. Фермент рестрикции не может расщеплять свою собственную (бактериальную) ДНК, т.к. в сайтах рестрикции бактериальная ДНК модифицирована метилированием, которое осуществляется особым ферментом – ДНК-метилазой. В бактериальной клетке существует система рестрикции-модификации. Определенные рестриктазы специфически узнают только свои «мишени», состоящие из 4–6 пн и разрезают ДНК в середине или несколько в стороне от этой последовательности, делая соответственно прямые или ступенчатые разрезы в обоих цепях ДНК (рис. 1). В последнем случае образуются «липкие» (выступающие одноцепочечные) концы, которые благодаря комплементарности оснований могут вновь замыкаться с образованием водородных связей. То есть концы, сформировавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, мо-
5