Курсовая работа (т): Производственный ветсанконтроль, ветсанитария, ветсанэкспертиза и профилактика сибирской язвы при производстве, переработке и реализации продукции животного происхождения

При кишечной форме, протекающей у свиней главным образом хронически, отмечают ограниченные воспалительные геморрагические отеки в кишечнике, наиболее заметные на серозной оболочке, которые быстро некротизируют, принимая вид крошковатых образований зеленовато-желтого или желто-серого цвета. Впоследствии они отпадают, а на их месте остаются язвы с изъеденным дном, неровными краями и кровоизлияниями. При заживлении образуются рубцы со стянутыми краями.

Региональные брыжеечные лимфатические узлы подвергаются типичным для сибирской язвы изменениям. Иногда отмечаются кровоизлияния только в одном лимфатическом узле и небольшой отек брыжейки.

Таким образом, при ветеринарно-санитарной экспертизе туш и органов свиней необходимо осматривать глотку, гортань, подчелюстные, околоушные, шейные и брыжеечные лимфатические узлы.

При атипичной форме сибирской язвы у свиней иногда находят гиперемию поясничных лимфатических узлов и кровоизлияния в корковом слое почек, плохое обескровливание туш и др. Атипичные формы течения сибирской язвы у домашних животных не всегда четко выражены, что затрудняет диагностику. Поэтому при всех неясных патологоанатомических изменениях в тушах и органах следует предполагать сибирскую язву и ставить диагноз после проведения бактериологических исследований. [6]

сибирский язва туша экспертиза

1.7 Лабораторная диагностика

Исследование на сибирскую язву включает микроскопию мазков из исходного материала, высевы на питательные среды, постановку основных и дополнительных тестов идентификации, использование МФА для обнаружения антигенов и антител к ним, постановку ПЦР, биопробы и реакции преципитации. У человека и свиней, в случае невозможности установить диагноз вышеперечисленными методами, обязательна постановка клинической кожно-аллергической пробы с сибиреязвенным аллергеном.

.7.1 Материал для исследования

Материал от животных:

) продовольственное сырье и продукты животного происхождения;

) объекты окружающей среды - почва, трава, фураж, подстилка, вода и т.д.

Забор всех видов материала осуществляется в стерильную стеклянную или пластиковую посуду, соответствующую объему проб. Иммунофлуоресцентным, серологическим и бактериологическим методами исследуется соответствующий материал из общей пробы.

.7.2 Взятие материала от животных

В случае падежа животного в лабораторию направляют ухо и мазок, полученный из надреза уха. Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно ухо туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между лигатурами. Место отреза уха на трупе прижигают. Отрезанное ухо заворачивают в пергаментную бумагу, смоченную в дезинфицирующем растворе. Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного или в ходе вынужденного убоя, все манипуляции по вскрытию прекращают и на исследование направляют кровь, кусочки органов (селезенки, печени, лимфоузлов, в которых имеются характерные патологоанатомические изменения), костный мозг (из грудины или канала бедренной кости). Материалы от трупа необходимо брать и исследовать как можно раньше, так как из-за развития посторонней микрофлоры трудно выделить чистую культуру возбудителя сибирской язвы. От трупов свиней в обязательном порядке отбирают заглоточные лимфатические узлы и участки отечной соединительной ткани.

.7.3 Взятие материала из сырья животного происхождения

Взятие материала из сырья животного происхождения и из объектов внешней среды проводится в тех случаях, когда необходимо установить источник инфекции или фактор передачи, для выявления обсемененности спорами возбудителя сибирской язвы отдельных объектов, а также в целях обнаружения микроба в местах старых скотомогильников при проведении строительных, мелиоративных, гидротехнических и других работ, связанных с выемкой и перемещением грунта.

Из материала, доставленного на исследование, отбирают образцы весом 10-30 г, из мяса - участки с лимфоидной тканью или кровоизлияниями.

Шерсть:

Шерсть для исследования отбирают из разных мест, не менее 5 образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.

Кожа и кожсырье:

Берут кусочки кожи размером 3х3 см с периферических незагнивших и незаплесневевших участков шкурок. При наличии на внутренней стороне шкурки кровоподтеков или инфильтратов пробы берут и в этих местах.

1.7.4 Порядок проведения исследования

Все работы по проведению исследования материала подозрительного на наличие возбудителя сибирской язвы проводят с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

Исследования на сибирскую язву можно разделить на два этапа:

) обнаружение возбудителя или его компонентов (ДНК, антигенов) в организме больных людей, животных, секционном материале или объектах окружающей среды, с которыми имели контакт заболевшие и которые могли быть источником инфицирования;

) выделение и идентификация чистой культуры возбудителя с последующим изучением ее свойств.

При исследовании патологического материала от людей и животных готовят мазки из нативных проб, окрашивают их по Граму и люминесцирующими иммуноглобулинами, засевают на плотные и жидкие питательные среды, заражают лабораторных животных и проводят ПЦР-анализ. Для анализа проб кожи, шкуры и шерсти к уже указанным методам добавляется реакция преципитации и исключается бактериоскопия и МФА.

.7.5 Бактериоскопия

А) Световая микроскопия

Из поступившего патологического материала готовят несколько мазков, которые подсушивают на воздухе, фиксируют в спирте с добавлением 3% перекиси водорода не более 30 мин, после этого окрашивают по Граму и на капсулу одним из методов (по Ребигеру, Михину, Романовскому-Гимза). В окрашенных мазках из патологического материала сибиреязвенный микроб представляет собой грамположительные палочки, располагающиеся короткими цепочками или попарно. Концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. В отдельных случаях (чаще в мазках от человека или свиней) форма возбудителя сибирской язвы может быть нехарактерной (короткие, толстые или изогнутые, иногда зернистые палочки с вздутием посередине или на конце, возможно наличие "теней" микробов).

Для обнаружения капсул лучшей краской является раствор Ребигера (прилож. 2.2). На всю поверхность фиксированного мазка пипеткой наносят раствор Ребигера и выдерживают 30-60 сек, затем промывают водой и высушивают. В мазках из свежего патологического материала капсула вокруг микроба окрашивается в розовый или красно-фиолетовый цвет, тело микробной клетки - в темно-фиолетовый. В мазках из крови и спинномозговой жидкости палочки с капсулой увеличены, края микроба закруглены.

Б) Люминесцентная микроскопия - МФА

Для люминесцентной микроскопии делают мазки-отпечатки из экссудата брюшной полости и органов биопробных животных, мазки-отпечатки из отечной жидкости и внутренних органов людей и животных, мазки из подозрительных колоний, выросших из посевов проб на чашках с питательными средами. Мазки подсушивают на воздухе и фиксируют в этиловом спирте с 3% перекиси водорода в течение 30 мин. На высохшие фиксированные мазки наносят в рабочих разведениях, указанных на этикетке, диагностические сибиреязвенные люминесцирующие адсорбированные соматические иммуноглобулины. В исходных пробах могут быть обнаружены сибиреязвенные микробы в вегетативной или споровой форме. Мазки из смывов, суспензий, вытяжек из материалов, подозрительных на высокую контаминацию возбудителем сибирской язвы, обрабатывают диагностическими люминесцирующими адсорбированными антиспоровыми иммуноглобулинами.

.7.6 Посев на питательные среды

Подготовленный для исследования материал засевают на чашки Петри с МПА, агаром Хоттингера (рН 7,2), селективную дифференциально-диагностическую среду с 0,01% натрия фенол-фталеинфосфата и пробирку с МПБ. Для засева одной пробы желательно использовать не менее 5 чашек. Поверхность агара перед посевом должна быть совершенно сухой. Посев необходимо производить с помощью шпателя, предварительно нанося на поверхность агара 1-2 капли (0,1 мл) исследуемого материала.

После суточного роста сибиреязвенного микроба МПБ остается прозрачным, на дне образуется рыхлый осадок в виде "комочка ваты". При встряхивании пробирки бульон не мутнеет, осадок разбивается с трудом на мелкие хлопья. В отдельных случаях в МПБ появляется диффузный рост культуры (легкое помутнение), при встряхивании образуются муаровые волны, на поверхности бульона может наблюдаться рост в виде пристеночного кольца.

Из бульонной культуры делают мазки, окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. В мазках из бульонной культуры обнаруживают типичные цепочки, состоящие из сибиреязвенных палочек, из бульонной культуры с диффузным ростом - отдельные или парно расположенные палочки. Для получения чистой культуры из бульона делают высевы на плотные питательные среды петлей для получения изолированных колоний.

На следующий день плотные питательные среды просматривают визуально и под микроскопом при малом увеличении.

Посевы на селективной дифференциально-диагностической среде с фенолфталеинфосфатом натрия перед просмотром обрабатывают парами аммиака. Для этого в отдельную крышку от чашки Петри помещают фильтровальную бумагу и наливают на нее 1-2 мл аммиака водного (29%-го, концентрированного). Затем чашку с посевами (агаром вверх), без крышки, помещают на несколько секунд (пока не порозовеют колонии сапрофитов) в крышку с аммиаком. Таким образом обрабатывают все посевы. В силу того, что сибиреязвенный микроб не образует или продуцирует фосфатазу слабо, его колонии, как правило, не изменяют своего цвета. Колонии спорообразующих сапрофитов, в том числе и В. cereus, под действием паров аммиака приобретают розовый или красный цвет. С дифференциально-диагностической среды для выделения чистой культуры отбирают визуально и с помощью микроскопа при малом увеличении все колонии, не изменившие своего цвета после обработки парами аммиака или слабо порозовевшие.

Из всех отобранных колоний делают мазки на двух или более предметных стеклах. Мазки фиксируют и окрашивают двумя способами - по Ребигеру (или по Граму) и сибиреязвенной люминесцирующей соматической сывороткой. При просмотре мазков учитывают характерную для сибиреязвенного микроба морфологию (длинные нити, концы палочек обрублены), при окраске люминесцирующими сыворотками - специфическое свечение на 4 или 3. Для идентификации отбирают только колонии чистой культуры, которые состоят из характерных для сибиреязвенного микроба палочек. Их отсевают на секторы МПА или агара Хоттингера. Материал из всех других отобранных колоний рассевают петлей на отдельных чашках Петри с МПА или агаром Хоттингера для получения изолированных колоний.

На этом этапе исследования для получения чистой культуры сибиреязвенного микроба важно проводить рассев на неселективной среде. Посевы помещают в термостат на 18-20 ч, после чего проводят учет и отбор колоний для дальнейшей идентификации по полной схеме лабораторного исследования.

Из изолированных колоний повторно делают мазки, их фиксируют и окрашивают, как описано выше. При отсутствии достаточного количества культуры исследование проводят на следующие сутки после накопления биомассы.

1.7.7 Биологический метод

В день поступления материала, одновременно с бактериоскопией и посевами на питательные среды с целью выделения возбудителя сибирской язвы, в обязательном порядке проводят биологическую пробу на восприимчивых лабораторных животных.

Для постановки биологической пробы используют белых беспородных мышей (массой 18-2 г), морских свинок (массой 350-400 г) или золотистых хомяков (массой 60-80 г). Исследуемый материал, подготовленный соответствующим образом (раздел "Подготовка проб к исследованию"), суспендируют в небольшом объеме стерильного 0,9%-го раствора хлорида натрия и вводят подкожно во внутреннюю поверхность бедра 2 мышам в объеме 0,2-0,5 мл, 2 морским свинкам или 2 золотистым хомякам в объеме 0,5-1,0 мл. Гибель зараженных животных наступает через 1-3 сут., иногда позже. При вскрытии трупов биопробных животных, павших от сибирской язвы, отмечают характерный для сибиреязвенной инфекции студенистый геморрагический отек подкожной клетчатки на месте введения материала, гиперемию внутренних органов, увеличение селезенки и несвернувшуюся кровь. Из тканей и органов павших животных делают мазки-отпечатки, а также посевы на МПА или агар Хоттингера и селективную среду. Мазки-отпечатки фиксируют в спирте с 3% перекиси водорода в течение 30 мин, а затем окрашивают раствором Ребигера или метиленовой синькой. В мазках при микроскопии сибиреязвенные бациллы расположены короткими цепочками, попарно или поодиночке, окружены розовой капсулой, зачастую сливающейся вокруг групп микробов. В посевах при просмотре чашек вырастают крупные шероховатые колонии с бахромчатой периферией. Идентификацию выросших колоний проводят выше описанными методами.

В случаях, когда чистая культура возбудителя из посевов исходного материала на питательные среды получена раньше, чем наступает гибель зараженных этим материалом животных, суточной бульонной культурой заражают дополнительно двух мышей или морских свинок в дозах, указанных выше.

Наблюдение за животными ведут в течение 10 сут., после чего их исследуют, как описано выше. В целях ускорения исследования количество заражаемых белых мышей увеличивают до 6-10 особей и по одной мыши от каждой пробы забивают через 2-3 сут. после введения исходного инокулюма. В этом случае при вскрытии особое внимание уделяют месту введения. Если в исходном материале имеется достаточное количество сибиреязвенного микроба, то на месте введения можно обнаружить отек подкожной клетчатки. В мазках-отпечатках с места введения выявляются капсульные формы микроба, а в посевах - рост типичных колоний.

.7.8 Иммунно-серологические и аллергологические методы исследования

А) Реакция преципитации по Асколи

Реакция позволяет в короткие сроки обнаружить сибиреязвенный антиген в экстрактах из струпьев язв больных, органов умерших от сибирской язвы людей, шкур и органов павших животных. Для постановки реакции необходимы: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, экстракт из исследуемого материала и сибиреязвенный бактерийный антиген для контроля.

Перед постановкой реакции свежий биоматериал выдерживают в термостате в течение 18-20 ч. Экстрагирование проводят горячим и холодным способами. При этом следует учитывать, что в экстрактах, полученных горячим способом, меньше преципитиногенов.

Для получения экстракта из патологического материала и струпьев горячим способом материал измельчают, заливают 0,9%-м раствором натрия хлорида с 0,3%-м раствором карболовой кислоты в соотношении 1:10 и кипятят в течение 30-40 мин, при холодном способе - оставляют для экстрагирования на 16-18 ч при комнатной температуре. Полученные экстракты фильтруют до полной прозрачности через фильтровальную бумагу или вату, предварительно смоченные 0,9%-м раствором хлорида натрия. В узкие пробирки наливают 0,2-0,3 мл прозрачной сибиреязвенной преципитирующей сыворотки, а затем пастеровской пипеткой осторожно наслаивают на нее такое же количество полученного экстракта. Если реакция положительная, то на границе соприкосновения жидкостей не позднее 15 мин должно появиться мутно-белое кольцо. Реакция оценивается знаком (+). При сомнительной реакции появление кольца наблюдается позднее 15 мин (±). Если кольцо отсутствует, то реакция оценивается как отрицательная (-).

Одновременно необходимо ставить три контрольных пробы: преципитирующая сыворотка плюс коммерческий стандартный сибиреязвенный антиген; преципитирующая сыворотка плюс экстрагирующая жидкость; нормальная лошадиная сыворотка плюс коммерческий стандартный сибиреязвенный антиген. Все контроли, кроме первого, должны быть отрицательными.

Исследование кожевенного и мехового сырья на сибирскую язву в реакции преципитации по Асколи проводят в соответствии с "Наставлением по исследованию кожевенного и мехового сырья реакцией преципитации", утвержденным Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 25 мая 1971 г.