.7.9 Идентификация культур
Все выделенные культуры, подозрительные на принадлежность к В. anthracis, обязательно подвергают дальнейшему изучению биологических свойств, служащих критерием видовой идентификации, а при необходимости и целого ряда дополнительных свойств, являющихся основой для внутривидового типирования.
А) Морфология В. anthracis
В мазках из 18-24-часовых бульонных и агаровых культур вегетативные клетки имеют форму палочек, расположенных длинными цепочками. Концы бацилл в окрашенных препаратах обрублены и вогнуты, отчего цепочка напоминает бамбуковую трость с коленчатыми сочленениями. По Граму бациллы сибирской язвы окрашиваются положительно. Споры имеют овальную форму, внутри бактериальной клетки образуется одна спора, располагающаяся центрально, не превышая диаметра тела микробной клетки. Размеры вегетативных клеток сибиреязвенного микроба 1-1,5х6-10 мкм, спор - 0,8-1х1,5 мкм.
Морфологию спор определяют в культуре, полученной на плотной питательной среде при культивировании в течение 3-7 суток. Существует несколько способов окраски спор, основанных на том, чтобы сделать проницаемой для краски их плотную оболочку (Ауэски, Пешкова, Циля-Нильсена). Для дифференциации от других грамположительных бацилл мазки окрашивают сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками, ориентируясь при микроскопии на морфологию клеток и специфическое свечение (ярко-зеленая периферия и более темная сома клеток).
Б) Характер роста на плотных и в жидких питательных средах
Характер роста на агаровых средах определяют визуально невооруженным глазом или через лупу, а также под микроскопом, для чего чашку помещают на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете при малом увеличении и с суженной диафрагмой. Оценивают колонии по их морфологии: величине, форме, виду, цвету, характеру поверхности и края, прозрачности, структуре, консистенции, а также по специфическому запаху. На МПА и агаре Хоттингера возбудитель сибирской язвы формирует крупные шероховатые матовые серые сухие колонии в R-форме, с "шагреневой" поверхностью, неровными краями и отходящими от них волнистыми отростками, напоминающими при просмотре в микроскопе (малое увеличение) локоны волос или львиную гриву. Колонии сибиреязвенного микроба на плотных питательных средах отличаются от колоний спорообразующих сапрофитов меньшими размерами, большей шероховатостью и более выраженными "локонами" по периферии. Колония сибиреязвенного микроба с трудом берется бактериологической петлей, при этом за петлей поднимается тяж бактериальной массы. Агаровая культура сибиреязвенного микроба имеет специфический слегка ароматический запах.
При использовании дифференциально-диагностической среды с натрия фенолфталеинфосфатом учитывают одновременно два важных диагностических признака - характер выросших колоний и тест на щелочную фосфатазу.
В МПБ сибиреязвенный микроб растет в виде придонного "комочка ваты", бульон над которым остается прозрачным. "Комочек ваты" бульонной культуры В. anthracis с трудом разбивается при встряхивании, в отличие от подобного придонного роста некоторых представителей спорообразующих сапрофитов, легко разбивающегося и вызывающего помутнение среды.
В) Тест на подвижность
Одним из наиболее постоянных для сибиреязвенного микроба признаков является отсутствие подвижности, в отличие от большинства спорообразующих сапрофитов. Можно определить подвижность путем высева культуры уколом в столбик полужидкого (0,2-0,3%) агара. Посевы выдерживают в термостате при температуре (36±1)°С в течение 18-20 ч. В полужидком агаре рост сибиреязвенного микроба наблюдается только по следу укола, а окружающая среда остается прозрачной. Подвижные микробы дают диффузный рост. Простым методом определения подвижности является микроскопическое исследование в "висячей" или раздавленной капле, а также в камере Горяева 18-20-часовой бульонной культуры. Однако описаны и неподвижные варианты В. cereus и других сапрофитов.
Г) Тест на гемолиз
Для проведения этого теста готовят МПА или агар Хоттингера (рН 7,2) с 3-5% дефибринированной крови барана (прилож. 1.4). Посев испытуемых культур производят бактериологической петлей секторами и инкубируют в термостате при (36±1)°С в течение 18-20 ч, после чего учитывают результат. В эти сроки сибиреязвенный микроб не лизирует эритроциты барана в отличие от большинства родственных спорообразующих сапрофитов, образующих широкую зону гемолиза вокруг выросших колоний.
Д) Тесты на чувствительность к пенициллину
Тест "жемчужного ожерелья". Перед постановкой пробы остуженный до 45 С 2% питательный агар разливают по 10 мл в 3 пробирки. В первую добавляют пенициллин из расчета 0,5 ЕД/мл, во вторую - 0,05 ЕД/мл, третья - без антибиотика - остается контрольной. Содержимое каждой пробирки выливают в чашку Петри. После застывания среды дно чашек снаружи размечают на квадраты или кружки, на которых пишут номера анализа. На обозначенные участки наносят по одной капле изучаемых 3-6-часовых бульонных культур. На одной чашке может быть поставлено до 10 проб. Посевы инкубируют при (36±1)°С. Не позже 3 ч просматривают рост под микроскопом с иммерсионным объективом, предварительно накрыв каждый отмеченный участок покровным стеклом. На среде, содержащей пенициллин, видны шарообразной формы бактериальные клетки сибиреязвенного микроба, расположенных в виде цепочек, напоминающих ожерелье из жемчуга. Спорообразующие сапрофиты, как правило, устойчивые к пенициллину, имеют обычную бациллярную форму. В контрольной среде без пенициллина сибиреязвенный микроб формирует длинные цепи палочек.
Е) Метод определения гемолитической и протеолитической активности
Определение проводят в соответствии с методическими рекомендациями "Определение гемолитической активности у сибиреязвенного микроба" (М., 1989). С этой целью готовят двухслойный агар, используя в качестве первого слоя 1% агар Дифко на 0,9%-м растворе хлорида натрия, который разливают в чашки Петри по 20 мл. Для второго слоя готовят 0,7%-й агар на 0,9%-м растворе хлорида натрия, в который после охлаждения вносят следующие ингредиенты: для проверки гемолитической активности - 6% трижды стерильно отмытых в 0,9%-м растворе хлорида натрия эритроцитов барана; для определения протеолитической активности - желатин, казеин, бычий сывороточный альбумин и гемоглобин в концентрации 0,4%. После полного застывания верхнего слоя в агаровых пластинках пробойником делают по 6-7 лунок в каждой чашке, дно которых заливают каплей расплавленного 1% агара.
В лунки вносят по 0,1 мл 2-суточной бульонной культуры изучаемых штаммов. Учет производят через 48 ч инкубации при температуре (36±1)0С для выявления гемолитической и через 24 ч - при выявлении протеолитической активности. В последнем случае перед просмотром поверхность агара обрабатывают 20% раствором трихлоруксусной кислоты. Положительные результаты соответствуют обнаружению зон просветления в агаре вокруг лунок с культурой.
Ж) Тест на лецитиназу
Наличие или отсутствие лецитиназной активности определяют в жидкой желточной среде или на агаре Хоттингера, в который добавлен стерильно желток куриного яйца. В пробирки с 5 мл жидкой желточной среды засевают петлей суточную культуру и инкубируют в термостате при (36±1)0С. Возбудитель сибирской язвы, как правило, в течение нескольких суток инкубирования не свертывает желток, в то время как представители спорообразующих сапрофитов свертывают желток уже в первые сутки. На плотной питательной среде вокруг колоний сибиреязвенного микроба не формируются зоны ферментации желтка, в то время как вокруг колоний большинства сапрофитов, вырабатывающих активную лецитиназу, просматривается широкая беловатая непрозрачная зона. [7]
При дифференциальной диагностике у коров необходимо исключить эмфизематозный карбункул, злокачественный отек, пастереллез (отечная форма) и пироплазмидозы, тимпанию незаразного характера, лейкоз. У овец - брадзот, инфекционную энтеротоксемию и пироплазмидозы; у свиней - рожу, чуму, пастереллез; у лошадей - злокачественный отек, сверхострое течение инфекционной анемии, пироплазмидозы, петехиальную горячку, кормовые отравления.
Основой дифференциальной диагностики является комплексный метод исследования, в котором результаты лабораторной диагностики имеют решающее значение. [5]
При подозрении на сибирскую язву дальнейший убой животных приостанавливают. От подозрительной туши берут кусочки селезенки, измененные части ткани и пораженные лимфатические узлы и направляют в лабораторию для бактериоскопического и бактериологического исследований. До получения результатов исследований тушу и все органы изолируют в обособленное место. При установлении бактериоскопическим исследованием сибирской язвы тушу с органами и шкурой, не ожидая результатов бактериологического исследования, направляют для уничтожения (сжиганием) при соблюдении установленных ветеринарно-санитарных правил.
Все обезличенные продукты (ноги, уши, вымя, кровь и др.), полученные от убоя других животных, смешанные с продуктами убоя от сибиреязвенного животного, сжигают.
Шкуры от здоровых животных, контактировавшие со шкурой от животного, больного сибирской язвой, подлежат дезинфекции в порядке, предусмотренном действующей Инструкцией по дезинфекции сырья животного происхождения и предприятий по его заготовке, хранению и обработке.
Примечание. Во всех случаях, когда в Правилах указывается на необходимость дезинфекции шкур, они подлежат дезинфекции согласно упомянутой Инструкции.
После удаления сибиреязвенной туши и других продуктов убоя в убойном цехе немедленно проводят дезинфекцию согласно Инструкции о мероприятиях против сибирской язвы. Рабочим проводится экстренная профилактика сибирской язвы в соответствии с Инструкцией и методическими указаниями по лабораторной и клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей, утвержденной Минздравом СССР.
Другие туши и продукты убоя, подозреваемые в обсеменении бациллами сибирской язвы по ходу технологического процесса, немедленно подвергают обеззараживанию проваркой, но не позднее 6 ч с момента убоя, в открытых котлах в течение 3 ч с начала закипания, а в закрытых котлах при давлении пара 0,5 МПа в течение 2,5 ч. При невозможности провести обеззараживание в указанный срок эти туши должны быть изолированы в помещение при температуре не выше 10 град. С, а затем направлены на обеззараживание, как указано выше, но не позже 48 ч с момента убоя. Если это невыполнимо, то туши и продукты убоя, подлежащие обеззараживанию, должны быть направлены на утилизацию или сжигание.
Туши и продукты убоя, обсеменение которых бациллами сибирской язвы по ходу технологического процесса исключается, выпускают без ограничения.
При отрицательном результате бактериоскопического исследования тушу, подозреваемую в заражении сибирской язвой, оставляют в изоляции до получения заключения о результатах бактериологического исследования; необходимость проведения других мероприятий в цехе (дезинфекция и т.д.) определяется ветеринарным врачом. [8]
При обнаружении сибирской язвы на предприятие накладывают карантин и проводят следующие мероприятия.
При обнаружении трупа или больного сибирской язвой животного в загоне предубойного цеха (скотобазы) прием скота прекращают; труп направляют на техническую утилизацию или сжигают; все имеющееся поголовье подвергают клиническому обследованию и термометрии, свиней аллергическому исследованию с сибиреязвенным аллергеном; животных с повышенной температурой тела и положительно реагирующих на аллерген свиней изолируют и лечат; клинически здоровых животных и свиней из этой партии, не реагирующих на аллерген, немедленно убивают на санитарной бойне.
Вагон, прогоны, по которым перемещалась партия животных, среди которых обнаружено заболевание сибирской язвой, подвергают увлажнению дезинфицирующими растворами, тщательной механической очистке от навоза и последующей дезинфекции одним из средств, указанных настоящих Правилах; навоз из загона, где было обнаружено заболевание, и смежных с ним загонов подлежит сжиганию.
При обнаружении на конвейере характерных для сибирской язвы патологических изменений убой животных и движение продукции в цехе первичной обработки сырья останавливают, патологический материал направляют на лабораторное исследование. Пораженную тушу и соседние с нею (по две с каждой стороны) изолируют вместе с внутренними органами и шкурами. При лабораторном подтверждении сибирской язвы изолированные туши, внутренние органы и шкуры направляют на техническую утилизацию или сжигают. Прием скота прекращают и проводят дезинфекцию помещений (включая базу и прогоны), оборудования, спецодежды и других инфицированных объектов.
Пол в убойных цехах посыпают сухой хлорной известью с содержанием не менее 25% активного хлора из расчета 2 кг на 1 кв.м площади и затем увлажняют водой - 5 л на 1 кв.м, экспозиция - 1 ч.
Затем все поверхности оборудования и помещения (стены на высоту 2 м от пола) тщательно обмывают 5%-ным горячим (не менее 70 градусов) раствором кальцинированной соды и проводят дезинфекцию.
Инструменты (ножи, мусаты и др.) дезинфицируют путем кипячения в 0,5%-ном растворе кальцинированной соды в течение 90 мин или автоклавируют при 1,5 атм в течение 2-х ч. Менее ценные инструменты и другие металлические предметы обжигают.
Спецодежду обеззараживают автоклавированием или кипячением в воде в течение 90 мин. Все работники предприятия, соприкасавшиеся с животными, больными сибирской язвой, или полученными от них продуктами, должны быть ознакомлены с необходимыми мерами профилактики при сибирской язве и в обязательном порядке подвергнуты санитарной о6работке.
После проведения мероприятий по уничтожению возбудителя болезни проводят термометрию оставшихся на предубойной базе животных свиней подвергают аллергическому исследованию). При отсутствии подозрительных по заболеванию всех животных подают на убой.
Карантин с мясоперерабатывающего предприятия снимают после завершения комплекса мероприятий по обеззараживанию контаминированных объектов с контролем качества дезинфекции. [9]
В стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктах и на угрожаемых территориях территориальный центр госсанэпиднадзора и станция по борьбе с болезнями животных проводят:
регистрацию эпизоотических очагов в специальном журнале, который постоянно хранится в делах районной (городской) ветеринарной станции и в центре санитарно-эпидемиологического надзора, вместе с журналом обязательно хранят выкопировки с карт территории стационарно неблагополучных пунктов с обозначением на них места и границ почвенных очагов сибирской язвы; указанные места должны быть ограничены канавами (по всему периметру), обнесены изгородью, исключающей случайный доступ людей и животных, и обозначены табличками с надписью "сибирская язва";
контролируют проведение работ по ограждению и содержанию в надлежащем санитарном состоянии скотомогильников, отдельных старых захоронений животных и биотермических ям, обеззараживанию почвы в местах с достоверно установленными границами захоронений трупов животных, павших от сибирской язвы;
организуют постоянный надзор за санитарным состоянием мест скопления скота (базары, выставки, выводки и др.), заготовки, хранения и переработки сырья и продуктов животного происхождения.
В стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктах и на угрожаемых территориях:
не допускается вынужденный убой скота без разрешения ветеринарного врача; в случае вынужденного убоя запрещается реализация мяса и других продуктов в пищу людям и для кормления животных без лабораторного исследования;