Материал: Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Биохимия сельскохозяйственной продукции

15.1. Биосинтез полипептидной цепочки белка на рибосоме

Элонгация завершается при наличии в структуре мРНК одного из терминальных кодонов (УАА, УАГ или УГА). В терминации участвует белковый фактор (eRF), который присоединяется к терминирующим кодонам, блокируя дальнейший рост полипептидной цепи; еRF способен распознавать все три терминирующих кодона, которые совместно с белковым фактором способны инициировать активность пептидилтрансферазы. Фермент катализирует реакцию гидролиза, прекращая рост полипептидной цепочки. В результате происходит отделение полипептида от рибосомы

иосвобождение молекул тРНК и мРНК. Последняя подвергается распаду до свободных нуклеотидов в течение нескольких часов или суток. Свободная рибосома диссоциирует на субчастицы, которые при наличии новой мРНК могут быть использованы для реассоциации новой рибосомы.

Матричная РНК может транслироваться одновременно несколькими рибосомами, располагающимися близко друг к другу. Такая ассоциация рибосом получила название полисома.

Следует рассмотреть некоторые особенности протекания процесса биосинтеза белка. Прежде всего следует отметить, что начало трансляции

мРНК (инициация) не совпадает с началом полинуклеотидной цепочки мРНК. Это обусловлено наличием в структуре мРНК эукариот 5′-конце-

вых нетранслируемых последовательностей. Трансляция информации, закодированной в мРНК, начинается с первого 5′-конца метионинового кодона, которым является триплет АУГ. Однако это происходит только в том случае, если этот триплет находится в окружении двух нуклеотидов (А или Г), а непосредственно за ним должен следовать нуклеотид Г. Кроме того, на процесс инициации могут оказывать влияние также нуклеотиды, находящиеся в других положениях вблизи инициирующего кодона. Если первый триплет (АУГ) мРНК находится не в оптимальном контексте, то он пропускается и инициация начинается со следующего

триплета (АУГ). При этом на процесс инициации оказывают влияние наличие кэп-структуры на 5′-конце мРНК и поли(А) последовательности на противоположном конце полинуклеотида. При этом кэп-структура

иполи(А) последовательности должны быть узнаваемы специфическими белками, участвующими в процессе инициации. Поэтому инициация транскрипции может начинаться двумя способами. Путем кэп-сканиро- вания, когда мРНК просматривается с начала для поиска кодона АУГ, находящегося в оптимальном контексте, или за счет непосредственного узнавания в структуре мРНК внутреннего кодона АУГ, называемой внутренней инициацией. Для осуществления последнего механизма требуются особые клеточные белки.

Участие мРНК в процессе трансляции зависит еще и от присутствия в составе полинуклеотида кэп-структуры или наличия в 5′-нетранслиру- емой области кодонов АУГ, в контексте неоптимальном для инициации.

253

Глава 15. Метаболизм белков

Кроме того, на активность мРНК в процессе трансляции могут оказывать действие специфические регуляторные белки или регуляторные РНК (малые РНК). Эти белки и РНК способны связываться со специфическими последовательностями или структурами в мРНК, изменяя общую пространственную структуру мРНК и за счет этого препятствуя процессу инициации. Такие конформационные перестройки структуры РНК могут создавать трудности в связывании инициирующего кодона и 5′-конца мРНК с белоксинтезирующим аппаратом.

15.2. ФОЛДИНГ

Фолдинг — это процесс сворачивания полипептидной цепи в функционально активный белок, формирование которого происходит после завершения биосинтеза полипептида на рибосоме в специализированных образованиях. В результате фолдинга в водных растворах у водорастворимого полипептида уменьшается свободная энергия, гидрофобные остатки аминокислот упаковываются преимущественно вовнутрь молекулы,

агидрофильные остатки располагаются на поверхности белковой глобулы. Фолдинг в клетках эукариот обеспечивается специфическими белками, называемыми шаперонами, которые необходимы для эффективного формирования третичной структуры полипептидных цепей других белков, но не входят в состав конечной белковой структуры. Новосинтезированные белки после выхода с рибосом для правильного функционирования должны укладываться в стабильные трехмерные структуры и оставаться такими на протяжении всей функциональной жизни клетки. При этом шаперонами являются белки про- и эукариотических клеток, управляющие процессом правильной нековалентной укладки полипептидной цепи или полипептидсодержащих структур in vivo в упорядоченные третичные структуры. В эукариотических клетках места синтеза шаперонов — строма хлоропластов и матрикс митохондрий. Шапероны осуществляют транспортировку полипептидов от эндоплазматического ретикулума к субклеточным частицам, обеспечивая проход полипептида через мембраны,

азатем принимают участие в упорядоченной его укладке и сборке. Шапероны обладают сродством к экспонированным гидрофобным участкам полипептидной цепи. Связывание белка с шаперонами препятствует его агрегации с другими белками и тем самым создает условия для нормального сворачивания растущего полипептида. Действие шаперона сопровождается гидролизом АТФ, т. е. энергетически затратно. Количество шаперонов может резко возрастать под влиянием стрессов, таких как тепловой шок, химические воздействия, УФ облучение. В связи с этим шапероны называют белками теплового шока (Hsp — heat-shock proteins). При этом

254

15.2. Фолдинг

они выполняют функцию защиты белков клетки от денатурации. Шапероны обнаружены у различных бактерий, дрожжей, высших растений и животных. Различают одну группу шаперонов с молекулярной массой от 70 до 100 кДа (hsp60, hsp70, hsp90) и вторую группу с 800 кДа, имеющих сложную олигомерную (четвертичную) структуру и называемых шаперонинами. Белки — представители семейства hsp70 — связываются на начальной фазе образования растущего пептида. Одни из них контролируют процесс сворачивания белка в цитоплазме, другие — участвуют в переносе белков в митохондрии. Белки hsp60 охватывают синтезированный полипептид наподобие бочонка или цилиндра, тем самым обеспечивая условия для принятия правильной конформации.

Так, например, hsp60 митохондриальных клеток E. coli состоит из 14 субъединиц, построенных в форме цилиндра, имеющего внутри полость

°

с диаметром 45 A, в которой происходит сворачивание полипептидной цепочки. Вход в полость hsp60 шаперонина прикрывает ко-шаперонин hsp10,

всоставе которого семь субъединиц. Основная функция hsp10 заключается

втом, чтобы осуществлять контроль за формированием нативной структуры белка и обеспечивать его выход по окончанию процесса (рис. 15.2).

Полипептидная цепь

hsp70

hsp10

hsp60

Рис. 15.2. Структуры шаперонов и шаперонинов (Наградова, 1996)

Таким образом, в клетках живых организмов биосинтез белков осуществляется на специализированных органеллах — рибосомах. При этом носителем информации о качественном и количественном составе аминокислот, а также последовательности их связывания в первичной структуре белка является ДНК, с которой эта информация передается на различные

255

Глава 15. Метаболизм белков

типы РНК (рРНК, тРНК и мРНК) и затем реализуется в синтезе упорядоченной полипептидной цепочки, сворачивание которой в глобулу происходит в специализированных образованиях, с затратой энергии. В результате фолдинга клетка получает функционально активный белок.

15.3. ПРОТЕОЛИЗ

Процесс гидролитического разрушения нативной структуры белков до аминокислот называется протеолизом. Большинство внутриклеточных белков заканчивают существование в результате протеолитического гидролиза, превращаются в небольшие пептиды и свободные аминокислоты, которые утилизируются под действием ферментов митохондрий или включаются в первичные структуры новых белков на рибосомах. Многие протеолитические ферменты используют в качестве субстратов индивидуальные белки. Имеется множество протеиназ широкой субстратной специфичности, чья неразборчивость в субстратах компенсируется их строгой компартментализацией. Они локализованы в лизосомах и вакуолях, где гидролизуют любые белки после их попадания в эти органеллы. Такая компартментализация протеолитических ферментов является жизненно важным условием существования клетки.

Для растений характерно то, что процессы распада протекают активнее в прорастающих семенах. При этом белки эндосперма расщепляются до аминокислот, которые используются для построения белков в развивающемся зародыше. Процессы распада преобладают в клетках стареющих частей растения, а продукты распада перемещаются в репродуктивные органы, где наблюдается интенсивный синтез белков.

Гидролиз белков в растительной клетке осуществляется при участии гидролаз — специализированных ферментов, расщепляющих пептидные связи. Среди них можно выделить две группы, обладающие гидролитической активностью: протеиназы и пептидазы.

Протеиназы катализируют реакции гидролиза внутренних пептидных связей белков и пептидов. Так, среди протеиназ выделен специализированный фермент папаин, гидролизующий пептидные связи, в образовании которых участвуют остатки основных аминокислот, а также аминокислоты с алифатическими и ароматическими радикалами. Среди протеиназ выделяют ферменты, в составе активных центров которых содержатся сульфгидрильные группы (SH-группа), и ферменты, не содержащие их. Последние имеют схожий с ферментами животных (трипсин и пепсин) механизм действия. Активность протеиназ регулируется с помощью свободных или низкомолекулярных белков, образующих прочные комплексы с ферментами.

256

15.3.Протеолиз

Врасщеплении мелких фрагментов белков принимают участие пептидазы, среди которых выделяют три группы ферментов (аминопептидазы, карбоксипептидазы и дипептидазы). При этом аминопептидазы катализируют реакции гидролиза, отщепляя аминокислоты от полипептидной

цепи с конца, где располагается свободная NH2-группа. Карбоксипептидаза расщепляет пептидные связи вблизи свободной СООН-группы. Дипептидаза гидролизует пептидные связи у дипептидов.

Таким образом, совместное действие гидролаз обеспечивает в растительной клетке достаточно быстрое и полное расщепление белков. Причем, как показали исследования, активность ферментов, гидролизующих белки в растительных клетках, значительно выше, чем в клетках животных.

Кроме того, в клетках живых организмов активно функционирует система протеолитической деградации внутриклеточных белков с участием протеосом и убиквитина, которая отличается от вышеописанных систем тем, что, обладая широкой субстратной специфичностью, она безопасна для окружающих белков и реагирует на регуляторные воздействия. С участием компонентов этой системы протеолиз становится упорядоченным процессом, в реализации которого принимают участие множество клеточных протеаз, в частности убиквитин.

Убиквитин-зависимая система протеолиза проводит поиск потенциальной мишени для протеолитической деградации среди внутриклеточных белков. Белки несут специфические сигналы деградации по аналогии с сигнальными последовательностями, которые направляют вновь синтезируемые белки к определенным микрокомпартментам клетки. Сигналы протеолитической деградации более сложные и разнообразные, так как с их помощью не только маркируются белки, удаляемые с помощью протеолиза, но и определяется время удаления и скорость их протеолитического расщепления. Для распознавания и декодирования таких сигналов в клетках эукариот имеется убиквитин-конъюгирующая система. Как в ядре, так и в цитоплазме эта система отделена пространственно и функционально от протеолитических ферментов, организованных в протеасомы. Распознанные данной системой белки-субстраты маркируются путем ковалентного присоединения к ним молекул стабильного 76-звенного белка — убиквитина. Убиквитин соединяется C-концом с боковыми остатками лизина в субстрате. Наличие такой метки в белке является первичным сигналом сортировки, направляющей образовавшиеся конъюгаты к протеасомам. В большинстве случаев к субстрату присоединяется несколько молекул убиквитина, которые организованы в виде бусинок на нитке. Молекулы белков, содержащие убиквитин, по-видимому, являются для протеасом предпочтительными субстратами. Конъюгацию убиквитина с субстратом можно представить следующим

257