На правах рукописи
Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ CPLX2 И MAP1В, АКТИВНО ФУНКЦИОНИРУЮЩИХ В МОЗГЕ ЧЕЛОВЕКА
РАЕВСКАЯ НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА
МОСКВА - 2007
Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН (зав. лабораторией, доктор биологических наук, профессор С.А. Лимборская).
Научный руководитель:
кандидат биологических наук Л.В. Дергунова
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор В.В. Носиков кандидат биологических наук Н.С. Куприянова
Ведущая организация:
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Защита состоится “ ”_______2007 г. в ______часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП “Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов” по адресу: 117545, г.Москва, 1-й Дорожный проезд, 1. Факс: (495)315-05-01.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП “ГосНИИ генетика”
Автореферат разослан “____”_____________2007 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Заиграева Г.Г.
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Изучение структурно-функциональных свойств генов и особенностей регуляции их экспрессии относится к числу наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии. К настоящему моменту определены полные нуклеотидные последовательности геномов нескольких сотен различных биологических объектов, включая человека. В связи с этим чрезвычайно важную роль стали играть компьютерные методы хранения и анализа информации. Секвенирование геномных последовательностей, а также множества клонов кДНК из тканеспецифических клонотек привело к созданию банков данных накопленной информации, открывших широкую возможность для изучения структурно-функциональной организации транскрибируемых генов. Постоянно расширяющиеся базы данных позволяют осуществлять быстрый сравнительный анализ вновь появляющихся последовательностей и существенно облегчать формулировку предположений относительно их функциональной роли на основе сравнительного структурного анализа (Свердлов, 2000). Компьютерные методы анализа информации, накопленной в базах данных секвенированных генов и экспрессирующихся последовательностей, открыли возможность выявления огромного числа неизвестных ранее генов, позволили уточнить экзон-интронную структуру, наличие альтернативных продуктов транскрипции, определить тканеспецифичность экспрессии многих уже описанных генов.
Информация о последовательностях и одновременно разработанные новые технологии анализа экспрессии генов стали мощным инструментом для исследования генов, работающих в такой сложной структуре как мозг. Отличительным и уникальным свойством этого органа является присутствие в нем наибольшего по сравнению с другими тканями числа морфологически и функционально различающихся клеточных популяций, осуществляющих разнообразные функции, для реализации которых требуется множество белков - продуктов экспрессии огромного числа генов. По предварительным данным общее число генов человека составляет около 30 000, большая часть из которых функционирует в мозге. Изучение структурной организации генов, активно экспрессирующихся в мозге, является актуальным и фундаментально значимым для понимания молекулярно-биологических процессов, определяющих его нормальное функционирование. В дальнейшем это позволит исследовать роль генов, а также кодируемых ими белков в молекулярных механизмах, лежащих в основе многих заболеваний нервной системы.
Цель и задачи исследования
Ранее для обнаружения генов, специфически экспрессирующихся в мозге человека, на основе фракции полиаденилированной мРНК различных отделов головного мозга человека в нашей лаборатории были получены клонотеки кДНК. Дифференциальный скрининг клонотек позволил отобрать несколько клонов, в том числе Hfb1 (клон № 1 из клонотеки кДНК лобной коры головного мозга человека, human forebrain) и Hmob3 (клон № 3 из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, human medulla oblongata), последовательности которых показали преимущественную экспрессию в головном мозге человека (Буякова и соавт., 1992).
В целях выявления и идентификации генов, активных в тканях головного мозга человека и включающих последовательности Hfb1 и Hmob3, а также для иccледования их структурной организации и особенностей функционирования были поставлены следующие задачи:
· Определить первичную структуру экспрессирующейся последовательности Hmob3.
· Сравнить секвенированные участки HfbI и Hmob3 с последовательностями ранее изученных генов.
· Охарактеризовать структурную организацию генов, включающих последовательности HfbI (CPLX2) и Hmob3 (MAP1B).
· Исследовать in silico промоторные области, а также 5'- и 3'- нетранслируемые области транскриптов гена CPLX2, включающих последовательность HfbI.
· Оценить уровень экспрессии транскриптов гена CPLX2 в отделах мозга человека и крысы.
· Провести сравнительный анализ структурно-функциональной организации мРНК гена CPLX2 человека c транскриптами соответствующего гена мыши и крысы.
Научная новизна и практическая ценность работы
В результате исследования клонированной ранее мозгоспецифической последовательности HfbI удалось установить ее принадлежность 3'-концевой части гена комплексина 2 (CPLX2) человека. Впервые описана детальная структура гена CPLX2 человека, а также изучены особенности организации его транскриптов. Показано, что в регуляции функционирования исследуемого гена принимают участие механизмы альтернативного сплайсинга; идентифицированы и охарактеризованы два альтернативно сплайсируемых транскрипционных варианта мРНК. Высказаны предположения о возможных механизмах, регулирующих уровень активности гена CPLX2 и соответствующего белка в организме. Впервые исследована представленность транскриптов гена в разных отделах мозга человека и крысы. Впервые проведен сравнительный анализ нетранслируемых участков мРНК комплексина 2 между различными видами млекопитающих, обнаружено высокое сходство их организации.
Изучение клонированной последовательности Hmob3 позволило уточнить структурную организацию 3'-концевого участка гена МАP1B человека, а также особенности строения 3'-НТО его транскриптов. Показано, что изучаемый ген экспрессируется в мозге, почке и скелетной мышце человека. В почке и скелетной мышце также обнаружены новые варианты транскриптов гена МАP1B.
Результаты исследования, позволившие уточнить структуру генов CPLX2 и МАP1B, представляют большой интерес с позиции определения вклада анализируемых генов и их белковых продуктов в осуществление процессов, протекающих в головном мозге, в том числе и при патологических состояниях.
Информация о структурной организации транскриптов генов CPLX2 и МАP1B является значимой для дальнейшего изучения особенностей транскрипции и трансляции исследуемых генов. Идентификация функциональных элементов в промоторных областях гена CPLX2, а также в 5'- и 3'-НТО его транскриптов позволяет сформулировать гипотезы относительно механизмов регуляции активности данного гена и разработать подходы к экспериментальным исследованиям влияния этих областей на эффективность его экспрессии.
Сведения о характере экспрессии исследуемых генов CPLX2 и МАP1B в отдельных тканях могут представлять интерес с точки зрения изучения дальнейшей роли одноименных белков, а также механизмов их взаимодействия с другими белками в исследуемых тканях в норме и при патологии.
Место проведения работы
Работа была выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН. Отдельные эксперименты выполнены в Лаборатории сравнительной генетики животных Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, а также в Центре коллективного пользования «Геном» Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.
Апробация работы
Основные положения работы были представлены на III конференции молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (1998, Москва, Россия); ежегодных конференциях “Геном человека” (1998, 1999, Черноголовка, Россия); 2-м cъезде Российского общества медицинских генетиков (2000, Курск, Россия); школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (2000, Пущино, Россия); III съезде биохимического общества (2002, Санкт-Петербург, Россия); Human Genome Meeting (2002, Scanghai, China); конференциях Американского общества генетиков человека (1997, 1998, 2000, 2001) и Европейского общества генетиков человека (2002, 2005). Диссертационная работа была апробирована на заседании Ученого совета Института молекулярной генетики РАН 19 марта 2007 г. и на заседании секции "Молекулярная биология" Ученого Совета ФГУП "ГосНИИ генетика" 5 апреля 2007 г.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них - 5 статей и 14 материалов симпозиумов и конференций.
Структура и объем работы
Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, содержат 20 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 250 источников.
2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Первичную структуру клона Hmob3 определяли методом Сэнгера, размер секвенированного участка составил 1420 н. Последовательность Нfb1 была секвенирована ранее, ее длина составляла 985 н. (Буякова и соавт., 1992). Использование картирующей панели соматических гибридных клеток типа “человек-грызун” позволило локализовать последовательности Нfb1 и Hmob3 на хромосоме 5 человека. Сравнение Нfb1 и Hmob3 с последовательностями, депонированными в базе данных ГенБанк не выявило какой-либо гомологии с известными ранее генами и позволило считать, что мы имеем дело с новыми генами или с неописанными ранее участками известных генов. Отсутствие протяженных рамок считывания в первичной структуре этих последовательностей, а также тот факт, что они были отобраны из клонотек кДНК, полученных с использованием олиго(dТ)-праймеров, свидетельствовало об их принадлежности 3'-нетранслируемым областям мРНК.
1. Нозерн-гибридизация ДНК клонов HfbI и Hmob3.
Особенности экспрессии последовательностей Hfb1 и Hmob3 в тканях человека исследовали методом Нозерн-гибридизации. ДНК меченой рекомбинантной плазмиды, содержащей вставку Hfb1, гибридизовали с суммарными полиаденилированными мРНК, выделенными из мозжечка, таламуса, почки, легкого и скелетной мышцы человека (рис.1А). При гибридизации в препаратах РНК, полученных из отделов мозга, выявлены транскрипты, размер которых составлял около 5 т.п.н. В препаратах мРНК из почки, легкого и скелетной мышцы гибридизационный сигнал отсутствовал.
Нозерн-гибридизация клона Hmob3 с суммарными полиаденилированными мРНК мозжечка и лобной коры человека позволила обнаружить транскрипт, размер которого существенно превышал 5 т.п.н. В препаратах мРНК почки присутствовал транскрипт большего размера, в то время как в мышечной ткани детектировали оба транскрипта (рис.1Б). При гибридизации ДНК клона с мРНК легкого, печени и селезенки гибридизационный сигнал не выявлялся, что свидетельствовало об отсутствии или низком уровне транскрипции исследуемой последовательности в данных тканях (данные не представлены).\
Рис.1. Нозерн-гибридизация 32Р- меченой ДНК последовательностей клонов Hfb1 (А) и Hmob3 (Б) с поли(А+)РНК различных тканей человека. (А) 1 - мозжечок, 2 - таламус, 3 - почка,4 - легкое, 5 - скелетная мышца. (Б) 1 - мозжечок, 2 - лобная кора, 3 - почка, 4 - скелетная мышца. 28S и18S - рибосомальная РНК.
2. Последовательность Hmob3 входит в состав 3'-нетранслируемой области мРНК гена МАР1В человека
Сравнение мозгоспецифической последовательности Hmob3 с последовательностями, депонированными в базе данных ГенБанк, наряду с большим количеством анонимных гомологичных EST выявило совпадение с ДНК геномного клона, включающего участок хромосомы 5 человека (ГенБанк, № АС012609). Эти результаты позволили предположить, что исследуемый нами ген или его часть локализуется в последовательности данного геномного клона. Cравнение участков клона АС012609, прилежащих к области перекрытия с Hmob3, выявило в базе данных ГенБанк большое количество EST, совпадающих с областью, примыкающей к 5'-концу Hmob3, в то время как полностью отсутствовали последовательности, гомологичные участку, находящемуся сразу за его 3'-концом. Обнаруженная транскрипционная активность исследуемого участка генома свидетельствовала о совпадении 3'-конца Hmob3 с 3'-концом транскрипта соответствующего гена. В пользу данного предположения служил тот факт, что на расстоянии 26 нуклеотидов от поли(А)-конца Hmob3 расположен канонический участок полиаденилирования ААTAAА. Дальнейший поиск гомологичных последовательностей показал, что на расстоянии 1130 н. от области перекрытия с 5'-концом Hmob3 заканчивался участок, совпадающий с 3'-концом мРНК МАР1В человека. Полученные результаты, а также выявленное высокое сходство Hmob3 с последовательностью участка геномного клона мыши (ГенБанк, № AF115776), 5'-концевая область которого включала 3'- нетранслируемую область гена МАР 1В (Meixner et al., 1999), позволили предположить, что Hmob3 входит в состав 3'-нетранслируемой области (3'-НТО) мРНК МАР1В человека.