Рис.7. Идентификация транскриптов гена CPLX2 в клетках мозга с помощью ОТ-ПЦР.
Выявленные продукты амплификации кДНК, полученные при комбинации прямых праймеров, комплементарных экзонам I, II (транскрипт BN000499) или A (транскрипт BN000500) с обратными праймерами, соответствующими перекрывающейся области транскриптов (экзоны III-V) подтверждали присутствие в препаратах мРНК мозжечка двух типов транскриптов, различающихся 5'-флангом (рис.7Б, дорожки 1-3; рис.7B, дорожки 1-2). Перекрывающиеся последовательности продуктов ПЦР также подтверждали существование у обоих транскриптов протяженной 3'-нетранслируемой области (рис.7Б, дорожки 5-7). Выявление в каждой реакции амплификации только одного продукта свидетельствовало об отсутствии других альтернативных вариантов транскриптов данного гена, кроме обнаруженных вариантов мРНК. В контрольном эксперименте при использовании в качестве матрицы геномной ДНК в присутствии пары праймеров F3/R3 размер полученного продукта (1873 н.) существенно превышал аналогичный на кДНК мозжечка (972 н.), что подтверждало присутствие интронов в этом участке гена и косвенно свидетельствовало об отсутствии примесей геномной ДНК в препаратах кДНК (рис.7Б, дорожка 4).
10. Исследование промоторных областей гена CPLX2.
Идентификация в мозжечке человека двух типов транскриптов гена CPLX2, различающихся 5'-НТО, предполагает использование альтернативных промоторов для инициации их транскрипции. Проведенный нами анализ in silico геномных последовательностей, фланкирующих 5'-концы экзонов I и А гена CPLX2, показал наличие промоторных областей, расположенных непосредственно перед ними и разделенных в геноме участком ДНК длиной 74 т.п.н. Эти области не содержат канонические последовательности (ТАТА, ССААТ, CpG островки), представляющие известные цис-действующие промоторные элементы, а включают множество сайтов связывания с различными белковыми факторами, в том числе AP1, AhR, AREB6, NRF1, Nkx 2.5, NF1, MOK-2, MZF1 и др. Взаимодействуя с соответствующими транскрипционными факторами, эти сайты могут потенциально участвовать в регуляции транскрипции широкого спектра генов (Arranz et al., 1994; Benekli et al., 2003). Не исключено, что обнаруженные элементы связывания транскрипционных факторов могут потенциально участвовать в регуляции инициации транскрипции исследуемого гена и обеспечении многообразия механизмов контроля его функционирования. Отличительной особенностью проксимального промотора гена CPLX2 является наличие протяженного GA-богатого повтора, который потенциально может участвовать в активации транскрипции многих генов как в присутствии, так и в отсутствии функционального ТАТА-элемента (Leverrier et al., 2000; Aguilera et al., 2003; Kotite et al., 2003). По другим источникам, в промоторах генов, не имеющих ТАТА-бокса, GA-повторы являются необходимыми для инициации транскрипции (Wyse et al., 2000). Таким образом, можно ожидать, что обнаруженный GA-повтор также активно участвует в транскрипции гена CPLX2.
11. Определение точек инициации транскрипции гена CPLX2.
Точки старта транскрипции гена CPLX2 определяли методом удлинения праймера в 5'-направлении на препаратах поли(А)+-мРНК мозжечка человека. В реакции использовали праймеры R8 и R9, специфичные экзонам 1 и А. Продукты реакции, фракционированные в 8%-ном денатурирующем полиакриламидном геле, на радиоавтографе были обнаружены в виде нескольких радиоактивных сигналов (рис.8А). Электрофорез в геле с высоким разрешением позволил уточнить размер двух продуктов реакции, специфичных экзону I (74 и 115 н.) и трех продуктов, специфичных экзону А (86, 87 и 111 н.) (рис.8Б, дорожки 1, 2). Длину наиболее протяженных продуктов реакции удлинения праймера R9 (307 и 238 н.), не выявляемых в секвенирующем геле, определяли с помощью программы BioDocAnalyse (Biometra, Германия). Идентичные результаты получены нами в экспериментах с полиаденилированными фракциями мРНК гиппокампа и лобной коры человека (данные не представлены). Таким образом, для каждого из альтернативных вариантов транскриптов гена CPLX2 выявлено несколько мест инициации синтеза.
Известно, что многие промоторы, не содержащие TATA-бокс, способны к инициации транскрипции с нескольких сайтов (Bender et al., 1986; Stutz et al., 1998). Возможно, отсутствие TATA-бокса в промоторных областях гена CPLX2 послужило причиной наличия нескольких мест инициации транскрипции. Отсутствие TATA последовательности описано для генов домашнего хозяйства или `housekeeping' генов, в число которых входят онкогены, гены факторов роста и др. (Bender and Kuehl, 1986, Stayner et. al., 1998). По некоторым данным, такая особенность наблюдается у генов, высоко экспрессирующихся в мозге (Sutcliffe et al., 1988).
12. In silico идентификация транскриптов комплексина 2 мыши. Эволюционный консерватизм транскриптов гена комплексина 2.
Сопоставление мРНК комплексина 2 мыши (ГенБанк, № NM_009946) с нуклеотидными последовательностями из баз данных EST мыши ГенБанка с помощью программы BLAST также позволило нам выявить огромное количество перекрывающихся
Рис.8. Определение точек старта транскрипции методом удлинения праймера в 5'-направлении.
Стрелками указаны продукты реакции, полученые на поли(A+) РНК мозжечка человека с праймеров R8 (дорожка v1) и R9 (дорожка v2), специфичных экзонам I и A соответственно. Светлыми и темными стрелками обозначены продукты, полученные с транскриптов BN000499 и BN000500, соответственно; размер фрагментов указан в нуклеотидах. (A) Электрофорез с низким разрешением. Продукты реакции, фракционированные в 8% полиакриламидном геле. M, маркер X174X174/HinfI. (Б) Электрофорез продуктов реакции в 8% ПААГ (высокое разрешение). G; A; T; C - маркерные дорожки, соответствующие продуктам секвенирования ДНК плазмиды pUC18.
EST и сконструировать два кДНК контига, которые были зарегистрированы в базах данных EMBL-Dаtа Bank (№№ BN000501 и BN000502). Эти контиги представляют первичную структуру двух транскриптов гена комплексина 2 мыши. Они различаются участками 5'-НТО длиной 350 и 227 н и совпадают на участке длиной 4589 н., включающей участок 5'-НТО (88 н.), кодирующую область (405 н.), а также 3'-НТО (4096 н.), содержащую протяженный GA-богатый повтор.
Сравнение кДНК контигов, представляющих первичную структуру транскриптов гена комплексина 2 человека и мыши, помимо консерватизма длины их 3'-НТО (около 4 т.п.н.) и высокой гомологии кодирующей области (92%) выявило сходство последовательностей 5'-НТО пар контигов BN000499/BN000501 и BN000500/BN000502 90% и 83% соответственно.
Сравнение 3'-НТО сконструированных транскриптов гена комплексина 2 человека и мыши позволило нам обнаружить шесть высоко гомологичных участков длиной от 40 до 416 н., сходство которых превышало 83%. Наибольшая степень гомологии выявлена в участках, фланкирующих 3'-концевые области транскриптов (табл.2). В таблице представлены также последовательности клонов анонимных EST крысы, свиньи и быка, высокое сходство которых с последовательностью 3'-НТО транскриптов мыши и человека позволяет предположить их принадлежность 3'-концам транскриптов гена комплексина 2 у этих организмов.
Таблица 2. Сравнение участков 3'-концевых последовательностей мРНК комплексина 2 человека и мыши с последовательностями EST базы данных ГенБанк.
Отличительной особенностью всех представленных последовательностей является отсутствие канонического сайта полиаденилирования ААТААА и наличие гексануклеотида ААGAAА. Участие ААGAAА в полиаденилировании нескольких типов мРНК описано для многих генов. Так, например, выявлена его роль в полиаденилировании мРНК одного из вариантов генов тяжелой цепи иммуноглобулина Е мыши, мРНК, кодирующих стерол-альфа-диметилазу свиньи и эндопероксид Н синтазу человека (Anand et al., 1997, Kojima et al., 2000). Высокий консерватизм функциональных участков этой области, свидетельствует, по видимому, об их определяющей роли в полиаденилировании транскриптов комплексина 2.
Ген комплексина 2 крысы представлен в базе данных ГенБанк последовательностями D70816 (912 н.) и U35099 (900 н.), кодирующими один и тот же белок, но различающимися участками 5'-НТО. Отсутствие достаточного количества секвенированных последовательностей в базе данных EST не позволяет в данный момент сконструировать полноразмерные транскрипты гена комплексина 2 крысы. Однако высокое сходство последовательностей U35099 и D70816 с контигами BN000499 и BN000500 соответственно позволяет предположить, что они, по-видимому, представляют фрагменты двух вариантов транскриптов гена комплексина 2 крысы - Cplx2_v1 и Cplx2_v2, сходных с альтернативными транскриптами человека CPLX2_v1 и CPLX2_v2.
13. Исследование уровня экспрессии транскриптов гена комплексина 2 в отделах мозга человека и крысы.
Для выявления в тканях человека транскриптов, соответствующих сконструированным контигам BN000499 и BN000500, применяли метод ОТ-ПЦР. В качестве матрицы использовали кДНК, полученные на препаратах тотальной мРНК мозжечка, лобной коры, гиппокампа, селезенки, лимфатического узла, печени, почки и легкого человека. На электрофореграмме оба варианта транскриптов детектируются во всех исследуемых областях мозга, тогда как в селезенке, лимфатическом узле, печени, почке и легком они не выявлены, подтверждая мозгоспецифический характер экспрессии данного гена (рис.9А).
Для сравнения уровня экспрессии выявленных транскриптов в лобной коре, мозжечке и гиппокампе человека нами был использован полуколичественный анализ, основанный на ОТ-ПЦР. Для его проведения были подобраны условия ПЦР, позволяющие сравнивать представленность транскриптов гена CPLX2 в отделах мозга. Число циклов, количество матрицы и температурные условия были оптимизированы для получения детектируемого количества продукта ПЦР на стадии экспоненциального роста. В качестве эндогенного контроля использовали ген GAPDH, характеризующийся постоянной экспрессией в разных тканях (“housekeeping gene”). После амплификации продукты ПЦР фракционировали в 6%-ном ПААГ, сканировали и количественно оценивали с помощью программы ImageQuant. Для вычисления относительного содержания транскрипта гена CPLX2 в тканях мозга определяли отношение интенсивности сигнала соответствующего продукта ПЦР к интенсивности продукта гена GAPDH.
Результаты исследования уровня экспрессии альтернативных транскриптов гена CPLX2 в отделах мозга человека представлены на диаграмме (рис.9А). Высокое содержание транскриптов CPLX2_v2 наблюдается во всех анализируемых областях мозга человека, в то время как транскрипты CPLX2_v1 на высоком уровне детектируются в мозжечке и менее представлены в коре и гиппокампе.
Рис.9. Анализ экспрессии транскриптов комплексина 2 в отделах мозга человека (А) и крысы (Б).
Верхняя часть: электрофорез в 1,5% агарозном геле продуктов амплификации кДНК мозжечка человека с использованием пар праймеров F2/R2 (CPLX2_v1) и F7/R2 (CPLX2_v2) и кДНК мозга крысы с парами праймеров F9/R10 (Cplx2_v1) и F10/R10 (Cplx2_v2). Внутренний контроль - продукты амплификации тех же кДНК с праймерами для GAPDH. Нижняя часть: диаграммы характеризует относительное содержание транскриптов комплексина 2 человека и крысы. Данные проанализированы статистически с использованием u-теста Mann-Whitney. Различия в экспрессии транскриптов комплексина 2 в коре и гиппокампе человека и транскриптов комплексина 2 в мозжечке и гиппокампе крысы являются статистически значимыми (* P < 0,05).
Различия в относительном содержании транскриптов СPLX_v1 и СPLX_v2 в коре и гиппокампе являются статистически значимыми (u-test Mann-Yutney).
Метод ОТ-ПЦР был также использован для определения относительного содержания транскриптов гена комплексина 2 в образцах кДНК мозжечка, лобной коры и гиппокампа крысы (рис.9Б). На представленной диаграмме высокий уровень экспрессии транскриптов Cplx_v2, инициируемых проксимальным промотором, отмечается в мозжечке и лобной коре, тогда как в гиппокампе он значительно ниже. В этом отделе мозга крысы наблюдается высокий уровень экспрессии транскриптов Cplx_v1, соответствующих экзонам I-V. Поскольку каждый из исследованных нами отделов мозга отличается многообразием клеточной организации и особенностями функционирования, то наблюдаемая дифференциальная представленность альтернативных вариантов транскриптов гена комплексина 2 скорее всего обусловлена специфичностью экспрессии данного гена внутри отдельных нейрональных популяций, формирующих эти структуры.
ВЫВОДЫ
1. Последовательность Hmob3, полученная из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека и локализованная на хромосоме 5, входит в состав протяженной 3'-нетранслируемой области мРНК МАР1В человека размером 4330 н., что существенно превышает величину 3'-НТО описанных ранее мРНК МАР1В.
2. По результатам in vitro и in silico экспериментов последовательность Hfb1, полученная из клонотеки кДНК лобной коры человека и локализованная на хромосоме 5, входит в состав протяженной 3'-нетранслируемой области мРНК гена комплексина 2 (CPLX2) человека.
3. Охарактеризована экзон-интронная организация гена CPLX2 человека. Показано, что общая длина гена CPLX2, включающего 6 экзонов и 5 интронов, составляет 87,5 т.п.н.
4. Установлено, что в результате альтернативного сплайсинга ген CPLX2 экспрессируется с образованием двух вариантов мРНК, различающихся участками 5'-нетранслируемых областей. Последовательность одного из них включает экзоны I, II, III, IV и V; последовательность другого не содержит экзоны I и II, а вместо них включает дополнительный экзон А.
5. Анализ in silico показал наличие в гене CPLX2 двух промоторных областей, расположенных непосредственно перед экзонами I и А. Альтернативные промоторы разделены в геноме участком ДНК длиной 74 т.п.н.
6. Регуляция экспрессии гена CPLX2 осуществляется предположительно за счет использования альтернативных промоторов и синтеза альтернативно сплайсируемых вариантов гена.
7. Ген CPLX2 экспрессируется в головном мозге, что согласуется с функциональной ролью одноименного нейрон-специфического белка, участвующего в передаче нейромедиаторов в синаптическую щель. Альтернативные варианты транскриптов комплексина 2 в разных отделах мозга человека и крысы представлены в разных соотношениях.