Для доказательства нашего предположения был проведен анализ экспрессии гена MAP1B методом ОТ-ПЦР. В препаратах кДНК мозжечка человека были выявлены протяженные продукты, 5'-концевые участки которых совпадали с последовательностью МАР1В, а 3'-концевые участки - с последовательностью Hmob3 или с геномной ДНК, прилежащей к ее 5'-концу (рис.2). Существование таких транскриптов свидетельствовало, что Hmob3 входит в состав 3'-НТО мРНК гена МАР1В человека. Об отсутствии примеси геномной ДНК в препаратах кДНК свидетельствовали контрольные эксперименты, когда в качестве матрицы для ПЦР использовали мРНК без предварительной ревертазной реакции. В этих экспериментах для всех пар праймеров продукты амплификации отсутствовали (рис.2Б, дорожки 3).
К моменту нашего исследования структурная организация гена МАР1В человека была установлена Lien и соавт.(Lien et al.,1994). Общий размер гена, состоящего из семи экзонов и шести интронов, составлял 101 т.п.н. Нуклеотидная последовательность мРНК МАР1В человека (ГенБанк, № L06237) была определена в результате секвенирования нескольких перекрывающихся клонов кДНК; ее размер составлял 9416 нуклеотидов, а длина 3'-НТО - 1787 н. Выявленные два альтернативных варианта мРНК МАР1В человека различались 5'-концевыми участками и имели совпадающие 3'-НТО, при этом размер 3'-фланкирующего экзона гена МАР1В человека составлял 1950 п.н. (Lien et al.,1994). Как показали результаты нашего исследования, размер 3'-НТО транскриптов гена МАР 1В человека существенно
Рис.2. Анализ протяженной 3'-нетранслируемой области транскриптов гена MAP1B человека с помощью ОТ-ПЦР: (А) Схематическое изображение локализации праймеров P3, P4, P5, P6 относительно последовательностей АС0102609, мРНК MAP1B и Hmob3.
Участки между праймерами соответствуют размерам ожидаемых продуктов амплификации кДНК мозжечка. Направление стрелок указывает ориентацию праймеров в направлении 5'-3'. (Б) Электрофореграмма продуктов OT-ПЦР, полученных на кДНК мозжечка (1), ДНК геномного клона (2) и тотальной РНК (3); Маркер - продукты гидролиза ДНК фага л рестриктазой Pst1.
превышает аналогичный участок описанных ранее мРНК и составляет 4330 н. Сопоставление нуклеотидной последовательности выявленных нами вариантов мРНК МАР1В с ДНК геномного аналога (ГенБанк, № АС012609) позволило определить длину последнего экзона данного гена - 4484 п.н. На основании полученных результатов и имеющихся в базах данных ГенБанк последовательностей EST и мРНК MAP1B человека (ГенБанк, №№ NM_005909, NM_032010), методом in silico нами были сконструированы контиги, соответствующие альтернативным вариантам транскриптов гена МАР1В человека. Они зарегистрированы в базе данных EMBL-Data Bank под №№ BN001084 и BN001085. Таким образом, исследование Hmob3 позволило определить новый участок 3'-концевого экзона гена МАР1В и, тем самым, уточнить его структуру.
3. Идентификация геномного клона, содержащего последовательность Hfb1.
Для исследования структурной организации гена, в состав которого входит последовательность Hfb1, мы использовали космидную клонотеку ДНК хромосомы 5 человека, любезно предоставленную Е.И.Фроловой (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН). Из космидной клонотеки отбирали клоны, гибридизующиеся с Hfb1. Размер участка хромосомы 5, содержащейся в клоне 11-7, превышал 20 т.п.н. Рестриктазное картирование и Саузерн-гибридизация фрагментов вставки клона с 32P меченой последовательностью Hfb1 позволили выделить участок ДНК, совпадающий с Hfb1. Была определена нуклеотидная последовательность этого участка, а также фрагментов, прилежащих к его 3'- и 5'-концам; общий размер секвенированного фрагмента, обозначенного нами как Ghfb (т.е. геномный аналог клона Hfb1), составил 5480 п.н. Последовательность Ghfb депонировали в базе данных ГенБанк под номером AF318943.
4. In silico анализ геномного клона Ghfb.
Сопоставление секвенированного фрагмента геномного клона Ghfb с последовательностями, депонированными в базе данных ГенБанк, позволило нам выявить ряд EST, высокогомологичных области, совпадающей с Hfb1, а также участку ДНК, прилежащему к ее 5'-концу (рис.3). Наибольшее количество EST совпадало с 3'-концевой областью Hfb1; в то же время в базе данных EST ГенБанк наблюдалось отсутствие транскрибируемых последовательностей, гомологичных участку, расположенному сразу за
3'-концом Hfb1. Полученные результаты свидетельствовали о совпадении 3'-конца Hfb1 c 3'-концом транскрипта соответствующего гена. Кроме того, 5'-концевая область секвенированного геномного клона показала 100% гомологию с тремя участками (в интервале с 341 по 933 н.) мРНК комплексина 2 человека. Это позволило предположить, что секвенированный фрагмент геномного клона представляет собой неописанный ранее участок, возможно, соответствующий одному из вариантов 3'-нетранслируемой области мРНК гена комплексина 2 человека. Представленная в тот момент времени в базе данных ГенБанк мРНК комплексина 2 имела длину 940 н. (ГенБанк, № U35100). Суммирование данной величины с длиной выявленной нами 3'-нетранслируемой области (около 4 т.п.н.) давало продукт размером около 5 т.п.н., что соответствовало длине транскрипта, полученного при Нозерн-гибридизации ДНК клона Hfb1 c суммарными полиаденилированными РНК из различных отделов головного мозга человека (рис.1A). Обнаруженные в базах данных ГенБанк последовательности EST AL119131 и AW896858, 5'-концы которых совпадали с 3'-концом мРНК комплексина 2, а 3'-концы - с геномной последовательностью Ghfb, подтверждали данное предположение (рис.3).
5. Выявление протяженной 3'-НТО мРНК CPLX2.
Доказательством наличия у мРНК комплексина протяженного 3'-нетранслируемого участка служит анализ экспрессии данного гена с помощью ОТ-ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК, полученную методом обратной транскрипции мРНК мозжечка человека. Пары праймеров были составлены таким образом, что один из них соответствовал мРНК комплексина 2, другой - участку ДНК геномного клона Ghfb (рис.4A).
Рис.3. Сопоставление секвенированного участка геномного клона Ghfb1 c нуклеотидными последовательностями мРНК комплексина 2 (NM_006650), Hfb1 (Y15167) и EST, представленными в базе данных ГенБанк.
Размеры полученных продуктов ОТ-ПЦР совпадали с размерами продуктов ПЦР ДНК геномного клона и соответствовали ожидаемым: 2,9 т.п.н. - праймеры C3/G7; 2,3 т.п.н. - C3/G6; 1,2 т.п.н. - C2/G5; 0,7 т.п.н. - C3/G3 (рис.4Б). В то же время, при амплификации кДНК мозжечка и ДНК геномного клона в присутствии других пар праймеров (С1/C4, C1/G1) наблюдали продукты разной длины. В случае пары праймеров C1/C4 размер ПЦР-продуктов кДНК составлял 0,6 т.п.н. и 1,3 т.п.н. для ДНК геномного клона, в присутствии C1/G1 - 0,9 и 2,0 т.п.н. соответственно (рис.4В). Различия в длине продуктов ПЦР в этом опыте свидетельствовали о присутствии интрона в исследуемом гене, а также служили косвенным доказательством отсутствия примеси геномной ДНК в препаратах кДНК. Таким образом, в препаратах мРНК присутствовали протяженные транскрипты, 5'-концевые участки которых совпадали с последовательностью мРНК комплексина 2, а 3'- концевые участки - с последовательностью Ghfb.
Рис.4. Анализ 3'-НТО мРНК комплексина 2 человека: схематическое изображение мест локализации праймеров С1-C4, G1, G3, G5-G7 относительно нуклеотидных последовательностей мРНК комплексина 2 и Ghfb, а также участков между праймерами, соответствующих размерам ожидаемых продуктов амплификации кДНК мозжечка.
Направление стрелок соответствует ориентации праймеров 5'-3'. (Б, В) Электрофореграммы продуктов OT-ПЦР, полученных на ДНК геномного клона (1) и кДНК мозжечка (2). Маркеры - продукты гидролиза ДНК фага л рестриктазами Pst I(М, M2) и HindIII и EcoRI (M1).
6. Физическое картирование Ghfb в геноме человека.
Для уточнения места локализации последовательности Ghfb в геноме человека совместно с сотрудниками Лаборатории сравнительной генетики животных под руководством Г.Е.Сулимовой (Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН) был проведен скрининг панели ДНК индивидуальных клонов радиационных гибридов соматических клеток (человек-хомяк) GeneBridge 4 методом ПЦР с использованием праймеров, специфичных к Ghfb. Сопоставление результатов скрининга с данными по локализации генов, представленными в базе данных Центра геномных исследований Института Уайтхэд (США) показало, что последовательность Ghfb располагается дистальнее маркеров рабочей рамки WI-6737 и AFMA109XA5 на 3,77 cR и 3,87 cR (LOD балл = 2.78), соответственно. Таким образом, последовательность Ghfb локализована в области 533,07 -537,37 cR хромосомы 5 (среднее значение - 535,2 сR) в соответствии с RH-картой этой хромосомы, построенной в Институте Уайтхэд (WI-RH-карта). В том же интервале и практически в том же месте в пределах точности метода (636,91 cR3000) находится ген комплексина 2 человека (CPLX2), что подтверждает расположение Hfb1 вблизи этого гена.
7. Анализ in silico мРНК гена CPLX2 человека.
Выявление протяженной 3'-нетранслируемой области мРНК гена CPLX2 человека, в состав которой входит последовательность Hfb1, свидетельствовало о значительно большей длине транскриптов гена CPLX2 и необходимости уточнения организации данного гена. Для уточнения структуры 5ґ- и 3'- концов транскриптов гена CPLX 2 человека нами был проведен анализ in silico баз данных ГенБанка (NR, EST). В качестве «виртуальной пробы» использовали последовательность мРНК CPLX2 (ГенБанк, № NM_0066500). Огромное число перекрывающихся последовательностей EST формировало контиг, удлиняющий мРНК CPLX2 в 3ґ-направлении на 3794 нуклеотида. Формируемый контиг (области перекрытия между отдельными EST составили не менее 50 нуклеотидов) совпадал с участком геномного клона AF318943, включающего последовательность Hfb1, и подтверждал наличие протяженной 3'-НТО у транскриптов этого гена (рис.5). Число последовательностей, гомологичных 5'-концевой области мРНК комплексина, было существенно меньше. Два EST клона (ГенБанк, №№ AL707430, BP200227), полученных из библиотеки кДНК мозга человека, имели сходство 97% и 99 % с участками с 8 по 258 и с 8 по 179 н. мРНК CPLX2 соответственно, удлинив исследуемый транскрипт в 5'-направлении на 80 нуклеотидов. Три перекрывающихся EST клона (ГенБанк, №№ AL118919, BQ716337, BP199904) имели сходство более 97% с мРНК CPLX2 в области перекрытия, начинающейся с 256 н. и, следовательно, также принадлежали этому гену. Однако они отличались от нее сходными между собой 5'-концевыми участками (рис.5). Эти результаты позволили предположить существование альтернативного транскрипта гена CPLX2, 5'-концевая часть которого отличается от известной ранее последовательности мРНК комплексина 2. На основании полученных данных нами были сконструированы контиги, представляющие первичную структуру двух транскриптов гена CPLX2 человека, различающихся между собой 5'-концевыми участками (рис.5).
Рис.5. Сравнение мРНК CPLX2 (NM_006650) с последовательностями из базы данных EST и NR ГенБанка. Показаны несколько кДНК клонов, полученных на основе мРНК мозга и высокогомологичных NM_006650.
Стрелками указано местоположение интронов на геномной последовательности AF318943. BN000499 и BN000500 - сконструированные in silico контиги, представляющие гипотетические варианты транскриптов гена CPLX2.
В базах данных EMBL-Dаtа Bank они зарегистрированы под номерами BN000499 и BN000500. Контиги BN000499 и BN000500 имеют длину 4807 и 4691 н. и различаются участками 5'-НТО длиной 338 и 222 н. соответственно. Совпадающая область транскриптов включает участок 5'-НТО (88 н.), кодирующую область (405 н.) и протяженную 3'-НТО (3976 н.).
8. Экзон-интронная организация гена CPLX2 человека.
Сопоставление сконструированных контигов BN000499 и BN000500 с геномными последовательностями хромосомы 5 человека из базы данных ГенБанк (HTGS) позволило нам уточнить длину всех выявленных экзонов и интронов гена CPLX2, а также определить канонические динуклеотиды AG/GT, фланкирующие его экзон-интронные границы (табл.1). Структурная организация гена CPLX2 и его транскриптов CPLX2 схематически представлена
Таблица 1. Экзон-интронные границы гена CPLX2 человека. Консервативные нуклеотиды ag и gt на концах интронов подчеркнуты.
на рис.6. Контиг BN000499 включает экзоны I-V, а длина соответствующей ему транскрипционной единицы составляет 87,5 т.п.н. Контиг BN000500 вместо экзонов I и II содержит последовательность, обозначенную как экзон А, локализованную внутри интрона II на расстоянии 7 т.п.н от экзона III; длина транскрипционной единицы составляет при этом 12,5 т.п.н. Перекрывающаяся область контигов начинается с экзона III и включает экзоны IV и V (рис.6).
Рис.6. Структурная организация гена CPLX2 человека и его транскриптов. Экзоны I-V и A представлены в виде прямоугольников; интроны - в виде прерывистых линий; отмечен вариант сплайсинга. Кодирующая область окрашена серым цветом. Указан размер каждой транскрипционной единицы.
9. Выявление двух вариантов транскриптов CPLX2 в клетках мозга человека. рибонуклеиновый кислота ген транскрипт
Присутствие в клетках мозга двух типов транскриптов, различающихся 5'-флангом и включающих совпадающую протяженную 3'-НТО, подтверждали методом ОТ-ПЦР. В реакции ПЦР использовали комбинации пар праймеров, позволяющие получить перекрывающиеся продукты амплификации, свидетельствовующие о структуре предполагаемых транскриптов, а также о наличии возможных альтернативных продуктов (рис.7А). При электрофорезе продуктов амплификации кДНК мозжечка в агарозном геле нами были выявлены фрагменты ожидаемых размеров: F1/R1 - 396 н., F2/R2 - 709 н., F3/R3 - 972 н., F4/R3 - 777 н., F5/R4 - 1410 н., F6/R5 - 1522 н. F7/R6 - 304 н. F8/R7 - 640 н.
Электрофорез продуктов ПЦР в 6% полиакриламидном геле. Размер рестрикционных фрагментов указан в нуклеотидах. (A) Локализация и направление праймеров F1-F8, R1-R7; размеры ожидаемых продуктов амплификации показаны схематически. Праймеры и продукты амплификации, общие для обоих типов транскриптов, расположены относительно транскрипта 1 (CPLX2_v1). (Б) Продукты амплификации, специфичные для транскрипта CPLX2_v1 (дорожки 1, 2) и общие для транскриптов CPLX2_v1 и CPLX2_v2 (дорожки 3, 5, 6, 7). Дорожка 4 (положительный контроль) - продукт амплификации, полученный на геномной ДНК. (B). Продукты амплификации, специфичные для транскрипта CPLX2_v2 (дорожки 1, 2). Маркеры - ДНК фага л, обработанная ферментами Pst I (М1) и HindIII и EcoRI (M2).