Автореферат: Влияние иммобилизационного стресса и внутримышечного введения неостигмина на активность ацетилхолинэстеразы и Na,K-АТФазы эритроцитов и головного мозга крыс

Влияние иммобилизационного стресса и внутримышечного введения неостигмина на активность ацетилхолинэстеразы и Na,K-АТФазы эритроцитов и головного мозга крыс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

стресс иммобилизационный неостигмин

Актуальность проблемы. Ацетилхолинэстераза (АХЭ) - фермент гидролиза нейромедиатора ацетилхолина - играет ведущую роль в механизме трансдукции нервного импульса в холинергических синапсах животных (Голиков С.Н., 1964; Маралев С.М., 1999; Taylor P., 1991). Необратимое ингибирование АХЭ нервной системы животных блокирует проведение нервного импульса и вызывает нарушение нормального функционирования организма, приводя в конечном итоге к его гибели (Голиков С.Н., Розенгарт В.И., 1964; Голиков С.Н. и соавт., 1986). Однако роль холинергической системы в организме не ограничивается только медиаторными функциями (Silman I. et al., 2005). Так, показано участие центральных и периферических холинергических систем в высвобождении АКТГ из гипофиза человека (Rich S.C. et al., 1981). Высказывались также предположения о дополнительных некаталитических функциях АХЭ, среди которых указывалось на её участие в развитии и функционировании нейронов благодаря способности влиять на транспорт аминокислот и гидролиз пептидов (Appleyard M.E., 1992; Grisaru D., 1999; Day T., 2002). Весьма вероятным является участие холинергических систем в развитии стресс-реакции (Фурдуй Ф.И. и соавт., 1985; Хайдарлиу С.Х., 1984, 1989).

Na,K-АТФаза - фермент плазматических клеточных мембран, осуществляющий сопряженный с гидролизом АТФ перенос ионов натрия и калия через мембраны против электрохимического градиента (Болдырев А.А., 2001; Skou J.C. et al., 1992; Scheiner-Bobis G., 2002). Благодаря градиенту ионов возбудимые клетки способны кодировать и передавать сигналы, что необходимо для нормального функционирования нервной системы и организма в целом. Таким образом, Na,K-АТФаза играет важную роль в реализации клеточных функций, в связи с чем активность этого фермента подвержена тонкой регуляции со стороны эндокринной и нервной систем.

В связи с вышеизложенным изучение регуляции активности Na,K-АТФазы в условиях стресса и оценка возможного вовлечения холинергических систем в этот процесс может дать дополнительную информацию о механизмах стресс-реакции на молекулярном уровне.

Изучению функциональной связи компонентов холинергической системы и Na,K-АТФазы было посвящено большое количество исследований (Елаев Н.Р., 1980; Елаев Н.Р. и соавт., 1983; Кривой И.И. и соавт., 2003; Кривой И.И. и соавт., 2004; Stewart D.J., 1981; Busch L., 2004), в которых демонстрировались эффекты ацетилхолина и н-холинорецептора на Na,K-АТФазу. Регуляторная роль компонентов холинергических систем на Na,K-АТФазу может реализовываться также путем их участия в стимуляции выработки эндогенных дигиталис-подобных факторов (ЭДПФ), снижающих активность Na,K-АТФазы (Кривой И.И. и соавт., 2003). Концентрация стероидных соединений, обладающих дигиталис-подобной иммунореактивностью, согласно ряду исследований может возрастать в тканях животных в стрессовых условиях (Kelly R.A. et al., 1985; Lichtstein D. et al., 1985; Hamlyn J.M. et al., 1989; Doris P.A., 1994; Buckalew V.M. et al., 1998; Grambert G. et al., 1998; Hamlyn J.M. et al., 1998 et al.).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании влияния иммобилизации как классического стрессорного раздражителя и внутримышечного введения неостигмина на активность ацетилхолинэстеразы и Na,K-АТФазы.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить маркеры стресс-реакции у крыс после иммобилизационного стресса различной продолжительности и после введения различных доз неостигмина.

2. Оценить состояние периферических и центральных холинреактивных систем у контрольных и опытных животных.

3. Изучить влияние иммобилизационного стресса различной продолжительности на активность Na,K-АТФазы эритроцитов и головного мозга крыс.

4. Изучить активность Na,K-АТФазы эритроцитов и головного мозга крыс после внутримышечного введения различных доз неостигмина.

Положения, выносимые на защиту.

- Острый иммобилизационный стресс и однократное введение неостигмина вызывают сходные изменения маркеров стресс-реакции, однако в случае применения антихолинэстеразного соединения эти изменения более значительны.

- В процессе адаптации животных к иммобилизационному стрессу и после однократного внутримышечного введения животным неостигмина происходит усиление секреторной деятельности надпочечников.

- Острый иммобилизационный стресс приводит к снижению активности Na,K-АТФазы в эритроцитах животных, что связано с присутствием в крови стрессированных животных эндогенных ингибиторов фермента.

- Влияние неостигмина в экспериментах in vivo на активность Na,K-АТФазы в эритроцитах и в микросомально-митохондриальных фракциях гомогенатов различных структур головного мозга животных зависит от дозы и режима введения соединения.

Научная новизна и научно-практическая значимость работы. Установлено, что однократное внутримышечное введение животным антихолинэстеразного соединения в дозах 0,08 мг/кг и 0,25 мг/кг массы тела приводит к более значительному снижению концентрации аскорбиновой кислоты в гомогенате надпочечников по сравнению с действием иммобилизационного стресса. Впервые выявлено увеличение концентрации аскорбиновой кислоты в гомогенате надпочечников после многократного внутримышечного введения животным неостигмина в дозе 0,08 мг/кг массы тела.

Выявлено, что у животных, адаптированных к иммобилизационному стрессу, снижена активность ацетилхолинэстеразы в гомогенате надпочечников и хвостатого тела. При этом обнаружены однонаправленные изменения активности ацетилхолинэстеразы и Na,K-АТФазы в хвостатом теле после адаптации к иммобилизации.

Впервые показано, что внутримышечное введение антихолинэстеразного препарата периферического действия в дозе 0,25 мг/кг массы тела животного вызывает снижение активности Na,K-АТФазы в различных структурах головного мозга. Многократное введение небольшой дозы неостигмина (0,08 мг/кг массы тела) приводит к активации Na,K-АТФазы эритроцитов животных.

Полученные результаты расширяют представление об участии холинергических систем в изменениях, происходящих в организме животных в ходе развития стресс-реакции и адаптации к действию экстремальных факторов.

Результаты исследования используются при проведении спецпрактикума «Кинетика ферментативных реакций» и при чтении спецкурса «Механизмы биохимической адаптации» для студентов, специализирующихся по кафедре анатомии и физиологии человека и животных Тюменского государственного университета.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на V Общероссийской научной конференции "Успехи современного естествознания" (Сочи, 2004), V Общероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Кисловодск, 2004), Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (С.-Петербург, 2005), IX Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2005), Всероссийской конференции "Менделеевские чтения" (Тюмень, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и результатов исследований, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список литературы включает 193 источников, в том числе 114 на иностранных языках. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками и 11 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Исследование проводилось на половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 150-200 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария на полноценной диете и были одного возраста. Предварительно оценивали двигательную активность крыс методом «открытого поля» (Меркель А.Л., 1976). Для дальнейших экспериментов использовались только «активные» крысы.

Для исследования иммобилизационного стресса животные были поделены на 4 группы. В первую группу вошли интактные крысы (контроль); во вторую - животные, подвергнутые однократному иммобилизационному стрессу в течение 40 мин (иммобилизация); третью группу составили крысы, адаптированные к повторным воздействиям стресса (адаптация); четвертую - крысы, перенесшие острое стрессорное воздействие после предварительной адаптации (адаптация + иммобилизация). Адаптацию создавали путем повторных сеансов иммобилизации животных в положении на спине. Длительность сеанса в 1-й день составила 15 мин, 2-й - 30 мин, 3-й - 45 мин, 4-й - 1 ч, далее по 1 ч в день через день, всего было 12 сеансов иммобилизации. Забой крыс производили в 3-й группе - на другой день после последнего сеанса, в 4-й - сразу после острого стрессорного воздействия, воспроизводимого через 48 ч после последнего сеанса иммобилизации.

При исследовании воздействия антихолинэстеразного препарата животные также были поделены на 4 группы. Животным первой опытной группы вводили внутримышечно раствор неостигмина (N-(мета-диметилкарбомоилоксифенил)-триметиламмоний-метилсульфат), приготовленный на 0,9% NaCl, в дозе 0,08 мг/кг массы тела животного однократно. Крысам второй опытной группы неостигмин в такой же дозе вводили по следующей схеме: первые 4 дня ежедневно, затем 8 раз через день (всего 12 раз). Животные третьей группы подвергались однократному действию неостигмина в дозе 0,25 мг/кг массы тела. Крысам контрольной группы вводили равный объем физиологического раствора. Дозы препарата были подобраны в предварительных экспериментах.

Для исследования использовали упакованные эритроциты, полученные из артериально-венозной крови путем отмывки охлажденным 0,145 М NaCl на 10 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4 при 25°С), и грубую микросомально-митохондриальную фракцию гомогенатов коры головного мозга, мозжечка, хвостатого тела, приготовленных в 9-кратном объеме 0,25 М сахарозы на 0,02 М трис-HCl буфере (рН 7,4 при 25°С), и надпочечников, гомогенизированных в 0,9% NaCl.

Активность Na,K-АТФазы в эритроцитах и гомогенатах рассчитывали по приросту неорганического фосфора (Фн) в присутствии и отсутствие уабаина. Содержание неорганического фосфора в пробах определяли методом Чена (Chen P.S. et al., 1957). Для выявления латентной активности фермента эритроциты предварительно инкубировали с 1,5% раствором Твин-20, а гомогенаты головного мозга - с 0,25% раствором дезоксихолата натрия. Стандартная инкубационная среда для определения активности АТФазы содержала в мМ: NaCl -- 100, КCl -- 20, трис-НСl -- 50 (рН 7,6 при 25°С), MgCl₂ - 3, ЭДТА -- 0,5 и АТФ -- 3. При необходимости в условиях эксперимента использовались инкубационные среды с различным содержанием MgCl₂. Активность ацетилхолинэстеразы определяли по методу Эллмана и соавт. (Ellman G.L. et al., 1961). Содержание белка в образцах определяли по методу Лоури и соавт. (Lowry O.H. et al., 1951). Определение содержания аскорбиновой кислоты и её окисленных форм (дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот) в надпочечниках проводили модифицированным методом Соколовского с соавт. (Соколовский В.В. и соавт., 1967). Эритроцитометрию проводили путем построения кривых Прайс-Джонса (Кост Е.А., 1975).

Полученные данные были обработаны методами вариационной статистики. Сравнительную оценку полученных результатов проводили с использованием непараметрического рангового U-критерия Уилкоксона (Манна-Уитни), рекомендованного для малых выборок (Лакин Г.Ф., 1990).

Результаты исследований и их обсуждение.

Определение маркеров стресс-реакции у животных после иммобилизации и внутримышечного введения неостигмина. Содержание аскорбиновой кислоты в надпочечниках животных может быть использовано в качестве маркера стресс-реакции наряду с другими критериями (концентрация кортикостероидов, лейкоформула и др.), поскольку аскорбиновая кислота играет роль кофермента в процессе синтеза катехоламинов (Розен В.Б., 1994) и изменение её концентрации в надпочечниках коррелирует с повышением в плазме крови животных гормонов стресса (Катюхин Л.Н. и соавт., 1984).

Действительно нами обнаруженно снижение концентрации аскорбиновой кислоты в надпочечниках животных, подвергнутых иммобилизации в различных режимах (табл. 1), что согласуется с данными Пшенниковой М.Г. и соавт. (1990) о содержании катехоламинов в крови у крыс при остром стрессорном воздействии и адаптации к нему.

Таблица 1 Содержание восстановленной и окисленных форм аскорбиновой кислоты в микросомально-митохондриальной фракции гомогената надпочечников крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу (M±m, мг%)

Примечание: n - объем выборки; ^u - p<0,05; ^uu - p<0,01- уровень достоверности отличий по сравнению с контролем согласно U-критерию Уилкоксона.

Результаты изучения содержания форм аскорбиновой кислоты в надпочечниках крыс, подвергнутых действию неостигмина (табл. 2), указывают на то, что в организме опытных животных в ответ на однократное внутримышечное введение антихолинэстеразного препарата в дозах 0,08 мг/кг и 0,25 мг/кг массы тела происходят изменения, сходные с изменениями, которые развиваются при классическом стрессе. Более значительное снижение восстановленной формы аскорбиновой кислоты у животных данных групп (на 54,6% и 76,3% относительно контроля соответственно) по сравнению с изменением её содержания у крыс, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу (на 38,4% по сравнению с контролем), позволяет предположить, что введение неостигмина животным приводит к более выраженной секреции катехоламинов надпочечниками. У животных после нескольких сеансов иммобилизации обнаружено снижение содержания аскорбиновой кислоты в надпочечниках на 58,9% по сравнению с контролем, в то время как после многократных внутримышечных введений животным неостигмина - увеличение концентрации аскорбиновой кислоты на 32,0% по сравнению с контролем. Данный факт указывает на то, что механизмы реализации стресса в условиях действия антихолинэстеразного соединения и классического стрессового раздражителя могут иметь отличия.