Автореферат: Влияние иммобилизационного стресса и внутримышечного введения неостигмина на активность ацетилхолинэстеразы и Na,K-АТФазы эритроцитов и головного мозга крыс

Таблица 2 Содержание восстановленной и окисленных форм аскорбиновой кислоты в микросомально-митохондриальной фракции гомогената надпочечников крыс после внутримышечного введения животным неостигмина (M±m, мг%)

Примечание: n - объем выборки; ^u - p<0,05; ^uu - p<0,01 - уровень достоверности отличий по сравнению с контролем согласно U-критерию Уилкоксона.

Исследование активности АХЭ в эритроцитах и в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов надпочечников и головного мозга крыс после иммобилизационного стресса и внутримышечного введения неостигмина.

Для оценки состояния периферической и центральной холинергической системы опытных животных исследовали активность АХЭ в эритроцитах и в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов надпочечников, коры головного мозга, хвостатого тела и мозжечка крысы (табл. 3, 4).

Обнаружено, что у животных после нескольких сеансов иммобилизации активность фермента была ниже контрольного значения в хвостатом теле на 15,5%, в надпочечниках - на 24,4% (табл. 4).

Эти результаты совместно с данными, полученными при изучении содержания аскорбиновой кислоты в надпочечниках животных, свидетельствуют об активации секреторной деятельности надпочечников у крыс после иммобилизации и в процессе адаптации к иммобилизационному стрессу.

Таблица 3 Активность АХЭ в эритроцитах (мкМ АТХ/мл клеток/ч) и в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов (мкМ АТХ/мг белка/ч) надпочечников и различных структур головного мозга крыс после однократной иммобилизации (M±m)

Таблица 4 Активность АХЭ в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов (мкМ АТХ/мг белка/ч) надпочечников и различных структур головного мозга крыс после адаптации к иммобилизационному стрессу (M±m)

После однократного внутримышечного введения животным неостигмина в дозе 0,08 мг/кг массы тела активность АХЭ в эритроцитах была на 30% ниже по сравнению с контролем (табл. 5), что обусловлено, вероятно, непосредственным взаимодействием специфического ингибитора АХЭ с ферментом эритроцитов.

Активность АХЭ в микросомально-митохондриальной фракции гомогената надпочечников животных, которым однократно вводили неостигмин в дозах 0,08 мг/кг и 0,25 мг/кг массы тела, была ниже контрольного уровня на 52,1% и 58,6% соответственно. После многократных введений антихолинэстеразного соединения в дозе 0,08 мг/кг массы тела изменений активности фермента в микросомально-митохондриальной фракции гомогената надпочечников животных обнаружено не было (табл. 5).

Таблица 5 Активность АХЭ в эритроцитах (мкМ АТХ/мл клеток/ч) и в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов (мкМ АТХ /мг белка/ч) надпочечников и головного мозга крыс после внутримышечного введения неостигмина в разных дозах (M±m)

Примечание: n - объем выборки; ^u - p<0,05 - уровень достоверности отличий по сравнению с контролем согласно U-критерию Уилкоксона.

Таким образом, результаты, полученные при исследовании активности АХЭ и содержания аскорбиновой кислоты в надпочечниках животных, подвергавшихся иммобилизационному стрессу и внутримышечному введению антихолинэстеразного препарата, свидетельствуют о том, что ингибирование АХЭ надпочечников животных неостигмином в экспериментах in vivo сопровождается усилением синтетической и/или секреторной деятельности исследованных желез внутренней секреции.

Исследование активности Na,K-АТФазы в эритроцитах и в микросомально-митохондриальных фракциях гомогенатов надпочечников и головного мозга крыс после иммобилизационного стресса.

Рис. 1. Активность Na,K-АТФазы в эритроцитах животных, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу (а) и адаптации к иммобилизации (б).

Примечание: исследование активности Na,K-АТФазы проводилось в стандартной среде для определения ферментативной активности; n - объем выборки; ^u - p<0,05 - уровень достоверности отличий по сравнению с контролем согласно U-критерию Уилкоксона.

Ранее было показано, что стрессовые воздействия, и, в частности, иммобилизация, приводят к изменению активности мембранных ферментов, в том числе АХЭ и Na,K-АТФазы (Рожковский Я.В. и соавт., 1991; Медведева И.А. и соавт., 1993). Однако практически отсутствуют данные об активности этих ферментов у животных в процессе адаптации к действию стресс-фактора. Нами проведено исследование активности Na,K-АТФазы в эритроцитах и в различных структурах головного мозга крыс, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу, а также адаптации к многократным иммобилизационным воздействиям и стрессированных после предварительной адаптации. Было обнаружено, что активность Na,K-АТФазы в эритроцитах крыс, подвергнутых однократной иммобилизации, была ниже контрольных значений (рис. 1а), а у животных других опытных групп не отличалась от контроля (рис. 1б).

Изменение активности Na,K-АТФазы в эритроцитах крыс, подвергнутых иммобилизации, может быть следствием выброса под действием стресса в периферическую кровь животных депонированных форм эритроцитов, представленных клетками разной степени зрелости. Долю «молодых» и «старых» форм эритроцитов в периферической крови можно определить на основании процентного соотношения эритроцитов разного диаметра в мазке крови животных, поскольку известно, что старение эритроцитов сопровождается уменьшением их диаметра (Кост Е.А., 1975). Результаты эритроцитометрии, представленные на рис. 2, свидетельствуют о том, что в крови животных, подвергнутых многократным иммобилизационным воздействиям и стрессу после предварительной адаптации, преобладали эритроциты меньшего диаметра, чем в контроле (рис. 2).

Рис. 2. Кривая распределения эритроцитов по диаметру в мазке крови животных.

Примечание: группы животных: 1 - контроль (n=10), 2 - адаптация (животные после нескольких сеансов иммобилизации, n=6), 3 - адаптация+иммобилизация (животные, стрессированные после предварительной адаптации, n=6).

В ряде работ было показано, что при старении эритроцитов происходит снижение активности мембранных ферментов, в том числе Na,K-АТФазы и АХЭ (Камышенцев М.В. и соавт., 1976; Медведева И.А. и соавт., 1993). Как показали наши исследования, в эритроцитах животных, подвергнутых однократной иммобилизации, активность Na,K-АТФазы была ниже контрольного уровня, а активность АХЭ не отличалась от контроля. Можно предположить, что обнаруженное снижение активности Na,K-АТФазы в эритроцитах животных, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу, обусловлено не только выбросом в периферическую кровь «старых» эритроцитов, но и может быть связано с увеличением в плазме крови стрессированных животных концентрации эндогенных дигиталис-подобных факторов (ЭДПФ) (Lichtstein D. et al., 1985; Buckalew V.M. et al., 1998;), которые являются ингибиторами Na,K-АТФазы (Therien A. et al., 2000).

Для проверки данного предположения было исследовано влияние плазмы крови животных, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу, на активность Na,K-АТФазы микросомально-митохондриальной фракции гомогената коры головного мозга крыс. Выявлено снижение активности фермента в микросомально-митохондриальной фракции коры головного мозга контрольных животных после инкубации с плазмой крови стрессированных крыс (рис. 3), что позволяет предположить присутствие в крови крыс, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу, факторов, ингибирующих Na,K-АТФазу.

Рис. 3. Активность Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогената коры головного мозга крыс контрольной группы после инкубации с плазмой крови контрольных (1) и стрессированных (2) животных.

Примечание: исследование активности Na,K-АТФазы проводилось в стандартной среде для определения ферментативной активности; n - объем выборки; ^u - p<0,05 - уровень достоверности отличий по сравнению с контролем согласно U-критерию Уилкоксона.

В результате исследования активности Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов различных структур головного мозга крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу, было обнаружено, что в хвостатом теле животных после нескольких сеансов иммобилизации (группа адаптации) активность фермента была достоверно ниже контрольных значений на 20,2% (табл. 6), а в мозжечке и коре головного мозга не отличалась от контроля.

Таблица 6 Активность Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов (мкМ Фн/мг белка/ч) различных структур головного мозга крыс после адаптации к иммобилизационному стрессу (M±m)

Примечание: n - объем выборки; ^uu - p<0,01 - уровень достоверности отличий по сравнению с контролем согласно U-критерию Уилкоксона.

Известно, что важная роль в функционировании Na,K-АТФазы принадлежит ионам магния, которые участвуют в образовании субстрата Mg-АТФ и способны разобщать протомеры фермента в ходе реакционного цикла (Болдырев А.А и соавт. 1989; Bonting et al., 1983). Кроме того, ионы магния обладают мембранотропными эффектами, влияя на фазовые переходы мембранных липидов (Болдырев А.А. и соавт., 1990; Кравцов А.В. и соавт., 2001).

Характер кривых зависимости активности Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогената хвостатого тела от содержания MgCl₂ в среде определения ферментативной активности в контроле и в опыте был одинаковым (рис. 4). Следовательно, способность фермента переходить из олигомерной формы в протомерную у опытных животных не изменялась. Вместе с тем активность Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогената хвостатого тела крыс, подвергнутых нескольким сеансам иммобилизации, была ниже контрольных значений при определении активности в средах, содержащих 6 мМ и 12 мМ MgCl₂, на 27,7% и 19,4% соответственно (рис. 4). Можно предположить, что изменение активности Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогената хвостатого тела крыс после нескольких сеансов иммобилизации обусловлено связыванием с молекулой фермента факторов, снижающих её активность. В ряде исследований было показано существование в головном мозге животных ЭДПФ, которые, как известно, ингибируют Na,K-АТФазу (Haber E. et al., 1987; Sancho J.M., 1998; Van Huysse J.W. et al., 1998; Lichtstein D. et al., 2001).

Рис. 4. Зависимость активности Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогената хвостатого тела от концентрации MgCl₂ в среде определения ферментативной активности.