Автореферат: Влияние иммобилизационного стресса и внутримышечного введения неостигмина на активность ацетилхолинэстеразы и Na,K-АТФазы эритроцитов и головного мозга крыс

Примечание. Группы животных: 1 - контроль, 2 - адаптация (животные после нескольких сеансов иммобилизации), 3 - адаптация+иммобилизация (животные, стрессированные после предварительной адаптации). ^uu - p<0,01 - уровень достоверности отличий по сравнению с контролем согласно U-критерию Уилкоксона.

Интересно отметить, что у животных, стрессированных после предварительной адаптации, активность Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогената хвостатого тела была достоверно выше контрольного уровня на 23,3% только в среде определения ферментативной активности, содержащей 12 мМ MgCl₂ (рис. 4).

Обращает на себя внимание тот факт, что у животных после нескольких сеансов иммобилизации активность АХЭ и Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов мозжечка и коры головного мозга не отличалась от контроля, в то время как в хвостатом теле опытных животных обнаружены однонаправленные изменения активности исследованных ферментов, что может быть связано с наибольшей представленностью холинергической системы в хвостатом теле по сравнению с другими структурами головного мозга (Чернышевская И.А., 1983).

Исследование активности Na,K-АТФазы в эритроцитах и в микросомально-митохондриальных фракциях гомогенатов головного мозга крыс после внутримышечного введения различных доз неостигмина.

Согласно исследованиям Кривого И.И. и соавт. (2003; 2004) Na,K-АТФаза может находиться под холинергическим контролем и/или контролем ЭДПФ. Специфическую активацию холинергических систем можно вызвать введением животным веществ, избирательно ингибирующих ацетилхолинэстеразу. Отмечено, что в ответ на введение животным антихолинэстеразных препаратов повышается концентрация эндогенного ацетилхолина, который способен стимулировать высвобождение из надпочечников кортикостероидов и других гормонов (Ажипа Я.И., 1981). Поскольку пути метаболизма ЭДПФ и гормонов надпочечников могут быть тесно взаимосвязаны (Doris P.A. et al., 1989; Shaikh I.M. et al., 1991; Hamlyn J.M. et al., 1998; Lichtstein D. et al., 1998), можно предполагать, что синтез и/или секреция ЭДПФ возрастает при активации холинергической системы надпочечников. В связи со сказанным в данной работе использовался антихолинэстеразный препарат преимущественно периферического действия с целью специфической активации холинреактивных систем периферических желез и, в частности, коры надпочечников.

В ходе исследований было обнаружено, что активность Na,K-АТФазы в эритроцитах после однократного внутримышечного введения животным неостигмина в дозе 0,08 мг/кг массы тела не отличалась от контрольных значений, а после многократного введения неостигмина в такой же дозе была выше контрольного уровня в среднем на 30% при всех концентрациях MgCl₂ в среде определения ферментативной активности (табл. 7). После однократного введения животным антихолинэстеразного соединения в дозе 0,25 мг/кг массы тела изменений активности фермента в эритроцитах по сравнению с контролем выявлено не было (табл. 7).

Таблица 7 Активность Na,K-АТФазы в эритроцитах (мкМ Фн/мл клеток/ч) крыс после внутримышечного введения неостигмина (M±m)

Примечание: n - объем выборки; ^u - p<0,05, ^uu - p<0,01 - уровень достоверности отличий по сравнению с контролем согласно U-критерию Уилкоксона.

Известно, что активность мембранных ферментов в эритроцитах разной степени зрелости неодинакова (Камышенцев М.В. и соавт., 1976; Медведева И.А. и соавт., 1993). Для определения доли «молодых» и «старых» эритроцитов в периферической крови животных после внутримышечного введения неостигмина строили кривые Прайс-Джонса, отражающие распределение эритроцитов в мазке крови животных по диаметру (рис. 5).

Рис. 5. Кривая распределения эритроцитов по диаметру в мазке крови животных после внутримышечном введения неостигмина.

Примечание. Группы животных: 1 - контроль (n=9), 2 - однократное введение неостигмина в дозе 0,08 мг/кг массы тела (n=5), 3 - многократное введение неостигмина в дозе 0,08 мг/кг массы тела (n=5), 3 - однократное введение неостигмина в дозе 0,25 мг/кг массы тела (n=4).

Из рисунка 5 видно, что после однократного внутримышечного введения животным неостигмина в дозах 0,08 мг/кг и 0,25 мг/кг массы тела средний диаметр эритроцитов в мазке крови уменьшился, в то время как после многократного введения препарата в дозе 0,08 мг/кг массы тела - увеличился. Результаты эритроцитометрии свидетельствуют о преобладании в крови животных после однократного введения неостигмина «старых» форм эритроцитов, а после многократного введения - зрелых и более «молодых» эритроидных клеток, чем и обусловлено выявленное нами повышение активности Na,K-АТФазы в эритроцитах крыс после многократного введения неостигмина в дозе 0,08 мг/кг массы тела. Скорее всего, появление в крови животных данной опытной группы «молодых» эритроцитов связано с активацией эритропоэза (Цейликман В.Э. и соавт., 1995).

Следующий этап работы заключался в исследовании активности Na,K-АТФазы в различных структурах головного мозга животных после внутримышечного введения различных доз антихолинэстеразного соединения. Было выявлено достоверное ингибирование Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов коры головного мозга, мозжечка и хвостатого тела животных после однократного введения неостигмина в дозе 0,25 мг/кг массы тела в среднем на 26%, 35% и 18% соответственно по сравнению с контролем при всех концентрациях MgCl₂ в среде определения ферментативной активности (табл. 8).

Таблица 8 Активность Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов (мкМ Фн/мг белка/ч) различных структур головного мозга крыс после внутримышечного введения неостигмина в дозе 0,25 мг/кг массы тела (M±m)

Примечание: n - объем выборки; ^u - p<0,05, ^uu - p<0,01 - уровень достоверности отличий по сравнению с контролем согласно U-критерию Уилкоксона.

Обнаруженное снижение активности Na,K-АТФазы может быть связано с изменением физико-химических характеристик мембраны нервных клеток. Известно, что изменение состояния липидного бислоя влияет на способность Na,K-АТФазы переходить из олигомерной формы в протомерную (Болдырев А.А. и соавт., 1989; Болдырев А.А., 2001). Результаты изучения активности Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов различных структур головного мозга в зависимости от содержания MgCl₂ в среде определения ферментативной активности указывают на то, что способность фермента переходить в потомерную форму у опытных животных не отличалась от контроля (табл. 8). Следовательно, можно предположить, что физико-химические характеристики мембран клеток головного мозга животных после однократного введения неостигмина в дозе 0,25 мг/кг массы тела не изменялись. Косвенным доказательством этого утверждения могут служить результаты изучения активности другого мембранного фермента - АХЭ - в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов коры головного мозга, мозжечка и хвостатого тела опытных животных. Какие-либо нарушения липидного матрикса мембраны нервных клеток привели бы к снижению активности АХЭ, однако согласно полученным результатам активность данного фермента в головном мозге животных после введения неостигмина в дозе 0,25 мг/кг массы тела не изменялась.

Другой причиной выявленного изменения активности Na,K-АТФазы в головном мозге может являться повышение содержания в организме опытных животных эндогенных ингибиторов (Buckalew V.M. et al., 1998; Hamlyn J.M. et al., 1998; Lichtstein D. et al., 2001). Необходимо отметить, что снижение активности Na,K-АТФазы в головном мозге животных после внутримышечного введения неостигмина в дозе 0,25 мг/кг массы тела отмечено нами на фоне ингибирования АХЭ надпочечников опытных животных. В этих условиях, вероятно, произошло накопление эндогенного ацетилхолина, под действием которого усилился синтез катехоламинов в коре надпочечников и, возможно, ЭДПФ, метаболизм которых связан с гормонами надпочечников (Lichtstein D. et al., 1998; Hamlyn J.M. et al., 1998 et al.). Подтверждением увеличения синтеза катехоламинов у животных, которым вводился неостигмин в дозе 0,25 мг/кг массы тела, является резкое снижение восстановленной формы аскорбиновой кислоты в гомогенате надпочечников животных этой группы.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены сходные изменения в содержании аскорбиновой кислоты в надпочечниках крыс после острого иммобилизационного стресса и адаптации к многократным иммобилизационным воздействиям и после однократного внутримышечного введения неостигмина в дозах 0,08 мг/кг и 0,25 мг/кг массы тела. После многократных внутримышечных введений животным неостигмина в дозе 0,08 мг/кг массы тела выявлено увеличение концентрации восстановленной формы аскорбиновой кислоты в надпочечниках на 32,0% по сравнению с контролем.

2. Показано, что многократные иммобилизационные воздействия и однократное внутримышечное введение животным неостигмина в дозах 0,08 мг/кг и 0,25 мг/кг массы тела вызывали снижение активности АХЭ в микросомально-митохондриальной фракции гомогената надпочечников крыс, что совместно с результатами по изучению содержания аскорбиновой кислоты в надпочечниках свидетельствует об усилении секреторной деятельности исследованных желез внутренней секреции в процессе адаптации животных к иммобилизационному стрессу и при специфической активации холинергической системы надпочечников.

3. Выявлено снижение активности Na,K-АТФазы в эритроцитах крыс, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу, на 20% по сравнению с контролем, при этом плазма крови стрессированных животных ингибировала Na,K-АТФазу микросомально-митохондриальной фракции коры головного мозга контрольных крыс на 22,8%. Адаптация к повторным иммобилизационным воздействиям приводила к снижению активности Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции хвостатого тела животных.

4. После однократного внутримышечного введения животным неостигмина в дозе 0,25 мг/кг массы тела обнаружено достоверное снижение активности Na,K-АТФазы в микросомально-митохондриальной фракции гомогенатов хвостатого тела, мозжечка и коры головного мозга на 20,5%, 32,9% и 27,6% соответственно по сравнению с контролем.

5. Совокупность полученных результатов позволяет предположить присутствие в крови животных после острого иммобилизационного стресса и в головном мозге животных после введения неостигмина в дозе 0,25 мг/кг массы тела факторов, ингибирующих Na,K-АТФазу.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дубровский В.Н., Кыров Д.Н., Силиванова Е.А., Шалабодов А.Д. Активность АХЭ и Na,K-АТФазы эритроцитов и грубой микросомально-митохондриальной фракции головного мозга крыс при остром иммобилизационном стрессе // Материалы V Общероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" г. Кисловодск, 19-21 апреля 2004 г. - Фундаментальные исследования. - 2004. - №1. - С. 51.

2. Дубровский, В.Н., Кыров Д.Н., Силиванова Е.А., Шалабодов А.Д. Активность Nа+,К+-АТФазы и ацетилхолинэстеразы в различных отделах головного мозга крыс при иммобилизационном стрессе различной продолжительности // Материалы V Общероссийской научной конференции "Успехи современного естествознания" г. Сочи, 27-29 сентября 2004 г. - Успехи современного естествознания. - 2004. - №8. - С.41-42.

3. Дубровский, В.Н., Кыров Д.Н., Силиванова Е.А., Шалабодов А.Д. Активность ацетилхолинэстеразы и содержание аскорбиновой кислоты в надпочечниках крыс при адаптации к иммобилизационному стрессу // Материалы II конференции "Фундаментальные и прикладные исследования в медицине" о. Крит, 3-10 октября 2004 г. - Фундаментальные исследования. - 2004. - №5. - С.108.

4. Дубровский В.Н., Кыров Д.Н., Силиванова Е.А. Активность Na,K-АТФазы и ацетилхолинэстеразы в надпочечниках и различных регионах головного мозга крыс при иммобилизационном стрессе различной продолжительности // Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" г. Санкт-Петербург, 14-16 апреля 2005 г. - Приложение к журналу "Вестник молодых ученых" (Серия "Науки о жизни"). - 2005. - С. 36.

5. Силиванова Е.А., Кыров Д.Н., Шалабодов А.Д. Регуляция активной Na,K-АТФазы головного мозга и эритроцитов крыс при стрессе // Материалы IX Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" г.Пущино, 18-22 апреля 2005 г. - С.95.

6. Дубровский В.Н., Кыров Д.Н., Силиванова Е.А., Шалабодов А.Д. Активность Na,K - АТФазы головного мозга и эритроцитов крыс при стрессе // Материалы Всероссийской конференции "Менделеевские чтения" г. Тюмень, 26-28 мая 2005 г. - С.126-129.