В конце Х1Х века благодаря работам Дюбуа-Реймона, Л.Герман и Ю.Бернштейн пытались связать электрические явления, возникающие в возбудимых тканях, со свойствами полупроницаемых клеточных мембран.
С 1949 г. Ходжкин, Хаксли, Катц, усовершенствовав микроэлектродную технику, положили начало экспериментальной разработке мембранной теории возбуждения.
Рис. 2. Распространение нервного импульса.
Запись, получаемая при перемещении волны активности последовательно под 2-мя электродами, когда оба они лежат на нерве.
ПОТЕНЦИАЛ ПОКОЯ И ПОТЕНЦИАЛ ДЕЙСТВИЯ
Потенциал покоя. Микроэлектродная техника (внутриклеточная регистрация биопотенциалов).
Микроэлектрод - стеклянная микропипетка, заполненная раствором электролита. Диаметр кончика менее 0,5 мкм позволяет ввести электрод внутрь клетки, не нарушая ее функции. Второй электрод (электрод сравнения) - в питающий раствор с исследуемой тканью. Потенциал внеклеточной среды принимается равным нулю. Электроды соединяются с согласующим устройством, потом с усилителем постоянного тока. В качестве регистратора используется осциллограф.
В момент прокола мембраны клетки микроэлектродом на экране осциллографа происходит резкое смещение нулевого уровня книзу (рис 3). Наблюдается поляризация мембраны - внутренняя сторона мембраны заряжена отрицательно относительно внешней. Это же касается заряда внутреннего содержимого клетки относительно внешней среды. Перемещение кончика микроэлектрода внутри клетки не приводит к изменению измеряемой разности потенциалов, если электрод не повредил клетку. Зарегистрированная разность потенциалов получила название потенциала покоя (ПП) или мембранного потенциала покоя (МПП).
Обычно величина МПП колеблется от - 70 до - 95 мВ.
Смещение мембранного потенциала кверху, т.е. уменьшение значения мембранного потенциала по модулю (уменьшение поляризации) называется уменьшением мембранного потенциала или деполяризацией; смещение книзу, т.е. увеличение по модулю значения мембранного потенциала (увеличение поляризации), называется увеличением мембранного потенциала или гиперполяризацией (рис. 4).
Рис. 3. Внутриклеточная регистрация мембранного потенциала.
А - схема установки для регистрации; Б - момент введения микроэлектрода в клетку. 1 - стеклянный микроэлектрод; 2 - электрод сравнения; 3 - усилитель; 4 - регистратор.
Рис. 4. Изменения поляризации (потенциала) мембраны.
Потенциал действия.
При неизменном функциональном состоянии клетки величина мембранного потенциала не изменяется. Поддержание постоянной его величины обеспечивается нормальным протеканием клеточного метаболизма.
При нанесении на клетку, в которой находится микроэлектрод, допороговых стимулов, можно зарегистрировать уменьшение мембранного потенциала (деполяризацию), которое обратимо (быстро проходит) и зависит от силы стимула, но до определенного уровня.
Ответы клетки при действии на нее допороговых раздражений могут суммироваться.
При деполяризации до определенного уровня (обычно - это смещение мембранного потенциала на 20-30% от величины МПП), называемого критический уровень деполяризации (КУД), возникает резкое колебание мембранного потенциала (рис 5), получившее название потенциала действия (ПД) или спайка или пик - потенциала. И как бы мы дальше не увеличивали силу раздражения, амплитуда потенциала действия уже не изменится (закон “все или ничего”).
Все изменения мембранного потенциала до КУД отображают местный процесс возбуждения, нераспространяющееся возбуждение или локальный ответ.
В ПД различают пик и следовые потенциалы. Восходящая часть пика - деполяризация, нисходящая - реполяризация.
Рис. 5. ПД и изменения возбудимости во время ПД.
Овершут - перезарядка мембраны или перескок - основная причина распространения возбуждения.
Именно эти овершуты, перескоки ПД и регистрировал в своих экспериментах Эмиль Дюбуа-Реймон. ПД - это всегда распространяющееся возбуждение.
Следовые потенциалы: отрицательный следовый потенциал (следовая деполяризация); положительный следовый потенциал (следовая гиперполяризация).
Амплитуда потенциала действия: нервные клетки 110 -100 мВ; скелетные и сердечные мышцы 110 - 120 мВ.
Продолжительность ПД нервных клеток 1 -2 мс.
Фазовые изменения возбудимости при генерации ПД (рис. 5).
Мерило возбудимости - порог раздражения. При местном, локальном, возбуждении возбудимость увеличивается. Т.е. когда мембранный потенциал достигает КУД, возбудимость повышена.
ПД сопровождается многофазными изменениями возбудимости:
Период абсолютной рефрактерности (АРП) соответствует фазе деполяризации потенциала действия, пику и началу фазы реполяризации, возбудимость снижена вплоть до полного отсутствия во время пика.
Период относительной рефрактерности соответствует оставшейся части фазы реполяризации, возбудимость постепенно восстанавливается к исходному уровню.
Супернормальный период соответствует фазе следовой деполяризации потенциала действия (отрицательный следовый потенциал), возбудимость повышена.
Субнормальный период соответствует фазе следовой гиперполяризации потенциала действия (положительный следовый потенциал), возбудимость снижена.
Если потенциал покоя присущ всем живым клеткам без исключения, то потенциал действия генерируется только возбудимыми клетками, является электрофизиологическим показателем возникновения и распространения процесса возбуждения по мембранам нервных и мышечных клеток.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ И ИОННЫЕ КАНАЛЫ
Биологические мембраны - это функционально активные структуры клеток, ограничивающие цитоплазму и большинство внутриклеточных структур; образуют единую внутриклеточную систему канальцев, складок и замкнутых полостей.
Структурная основа мембраны - двойной слой фосфолипидов, в который встроены мембранные белки. Толщина клеточных мембран 6-12 нм. Молекулы липидов амфотерны. Своими гидрофильными частями они обращены в сторону водной среды (межклеточная жидкость и цитоплазма), гидрофобные части молекул направлены внутрь фосфолипидного бислоя. Такая структура идеально подходит для раздела внеклеточной и внутриклеточной фаз.
Белки, интегрированные в двойной слой фосфолипидов своими полярными участками, образуют гидрофильную поверхность в водной фазе. Они выполняют различные функции: рецепторную, ферментативную, образуют ионные каналы, являются мембранными насосами и переносчиками ионов и молекул.
Большинство наших знаний об устройстве ионного канала, является результатом функциональной реконструкции. Каждый канал имеет устье, селективный фильтр, ворота и механизм управления воротами.
Часть каналов являются электроуправляемыми, т.е. управляются за счет разности потенциалов на мембране (потенциал-зависимые ионные каналы). Для этого рядом с каналом имеется электрический сенсор, который в зависимости от величины мембранного потенциала либо открывает ворота каналов, либо держит их закрытыми.
Второй вариант ионных каналов - рецептороуправляемые. Ворота управляются за счет рецептора, расположенного на поверхности мембраны (открываются при взаимодействии медиатора с рецептором). В некоторых рецептороуправляемых каналах между рецептором и воротным механизмом имеется промежуточная стадия (посредник типа цАМФ, протеинкиназы и т.д.)
Ионные каналы обеспечивают два важных свойства мембраны: селективность и проводимость.
Селективность - или избирательность канала обеспечивается его особой белковой структурой, геометрией канала.
Например, диаметр иона натрия - 0,19 нм, вместе с гидратной оболочкой он становится около 0,3 нм. Устье натриевого канала 0,3 - 0,5 нм. Чтобы пройти через канал (особенно через селективный фильтр), ион натрия или другой ион должен освободиться от гидратной оболочки и только в «голом» виде может пройти через канал. Слишком большой ион не может войти в устье, слишком маленький не способен отдать гидратную оболочку в селективном фильтре, поэтому не может выскочить из канала.
Натриевые каналы (рис. 6) имеют ворота 2-х типов - активационные (m-ворота) и инактивационные (h-ворота). В условиях покоя активационные ворота закрыты, но готовы в любую минуту открыться, а инактивационные - открыты. При снижении МП (деполяризация до 60 мВ) активационные ворота открываются и впускают ионы натрия в клетку, но вскоре начинают закрываться инактивационные ворота (происходит инактивация натриевых каналов). Некоторое время спустя закрываются активационные ворота, открываются инактивационные, и канал готов к новому циклу. Канал блокируется тетродотоксином, местными анестетиками (новокаин и др.).
Рис. 6. Работа натриевых каналов и «воротных» механизмов.
А - в покое m-ворота закрыты; Б - при возбуждении m-ворота открыты; В - закрытие h-ворот (инактивация) при деполяризации.
Калиевые каналы тоже достаточно селективны - в основном пропускают ионы калия. Блокируются тетраэтиламмонием. Процессы инактивации у них выражены слабо. Зато имеются особые калиевые каналы, активирующиеся при повышении внутриклеточной концентрации кальция и деполяризации клеточной мембраны. Активация калий-калльцийзависимых каналов ускоряет реполяризацию (восстановление МП покоя).
Кальциевые каналы. Входящий кальциевый ток недостаточно велик, чтобы нормально деполяризовать клеточную мембрану. Кальций выступает в роли вторичного
посредника (мессенджера). Активация кальциевых каналов обеспечивается деполяризацией клеточной мембраны, напр., входящим натриевым током. Инактивация кальциевых каналов происходит при повышении внутриклеточной концентрации свободного кальция. Однако белки цитоплазмы связывают кальций, что позволяет некоторое время поддерживать стабильную величину кальциевого тока, хотя и на низком уровне; при этом натриевый ток полностью подавляется. Блокируются кальциевые каналы ионами марганца, никеля, кадмия (2-хвалентные ионы), а также лекарственными веществами (верапамил).
Различают пассивный (без затрат энергии) и активный (энергозависимый) транспорт ионов через мембраны.
Пассивный идет за счет простой и облегченной диффузии.
Простая диффузия идет в соответствии с законом Фика - по химическому, электрохимическому или осмотическому градиенту. Напр., в клетке натрия 14 ммоль, а в среде 140 ммоль, в этом случае пассивный поток должен быть направлен в клетку.
Для пассивной простой диффузии вещество должно быть жирорастворимым. Гидрофильные вещества в фосфолипидном бислое мембраны пройти не могут.
Облегченная диффузия происходит или при наличии специализированных каналов или с участием переносчиков, которые специфически связываются с переносимой молекулой, а затем способствуют ее переносу по градиенту концентрации.
Активный транспорт ионов насосами клеточных мембран обеспечивает поддержание ионных градиентов по обе стороны мембраны. Энергия затрачивается на перенос данного вещества против градиента его концентрации.
Доказано участие в активном транспорте ионов специализированных ферментных систем - АТФ-аз, которые осуществляют гидролиз АТФ. Различают:
Натрий-калиевая-АТФ-аза («натриевый насос») обнаружена в мембранах клеток всех животных, растений и микроорганизмов. Это мембранный белок, имеющий два центра связывания ионов. Один из них (натриевый) расположен на внутренней поверхности клеточной мембраны, второй (калиевый) - на ее внешней поверхности. Специфическим ингибитором фермента является сердечный гликозид - строфантин (уабаин), блокирующий работу натриевого насоса. Гидролиз одной молекулы АТФ сопровождается выведением из клетки трех ионов натрия и закачиванием в клетку двух ионов калия. При увеличении количества ионов калия во внеклеточной среде или ионов натрия внутри клетки работа насоса усиливается.
Кальциевая-АТФ-аза («кальциевый насос») наиболее широко распространена в мембранах саркоплазматического ретикулума мышечных клеток.
Протонная-АТФ-аза («протонный насос») - в мембранах митохондрий.
МЕХАНИЗМЫ ПОТЕНЦИАЛА ПОКОЯ И ПОТЕНЦИАЛА ДЕЙСТВИЯ
Потенциал покоя.
Теория, объясняющая происхождение мембранного потенциала, базируется на двух основных положениях:
1. Мембрана избирательно проницаема для различных ионов. В состоянии покоя мембрана проницаема для катионов и практически непроницаема для анионов. В покое проницаемость для ионов калия гораздо выше, чем для ионов натрия.
2. В мембране имеется биохимический механизм (натрий-калиевая-АТФ-аза), обеспечивающий активный транспорт ионов калия внутрь клетки, а ионов натрия наружу.
В состоянии покоя в цитоплазме клетки ионов натрия в 10 раз меньше, чем снаружи, а ионов калия в 50 раз больше, чем снаружи.
Это состояние поддерживается работой насоса. Работает насос против градиента концентрации с затратой энергии.
В покое мембрана имеет более высокую проницаемость для ионов калия, чем для ионов натрия и тем более анионов, внутри клетки. По закону осмоса, несмотря на работу насоса, калий стремится выйти из клетки, а анионы не могут последовать за ним, что приводит к разделению зарядов и появлению на мембране потенциала, отрицательного внутри и положительного снаружи.