Материал: А27103 Василинец И. М., Колодязная В.С. Методы исследования

Некоторые водорастворимые витамины обладают интенсивной флуоресценцией. Нейтральные растворы рибофлавина (В₂) в воде и спирте флуоресцируют желто-зеленым светом (λ_max = 535 нм). Выход флуоресценции падает при наличии кислот и щелочей. Эти свойства используются в различных вариантах люминесцентного метода определения витамина В₂ в пищевых продуктах. Чувствительность метода составляет в среднем 0,05 мкг/мл.

Витамин В₁ определяют по свечению продукта его окисления красной кровяной солью – тиохромом, имеющим интенсивную флуоресцен- цию голубого цвета (λ = 460…470 нм) при возбуждении светом около 260…277 нм.

Амид никотиновой кислоты имеет голубую флуоресценцию, так же, как и продукты окисления фолиевой кислоты.

Растворы аминокислот – фенилаланина, триозина, триптофана – обладают интенсивной флуоресценцией при 282, 303, 348…359 нм соответственно. Алифатические и серосодержащие кислоты и гистидин не люминесцируют.

Люминесценция белков обусловлена наличием в них ароматических кислот. Однако их спектры несколько отличаются от спектров флуоресценции свободных аминокислот. Положение полос может также меняться при изменении рН среды и степени денатурации белка.

Проведению анализа по спектрам флуоресценции предшествует сложная обработка пробы в целях концентрирования и выделения этого типа соединений, а также разделения их на группы.

В настоящее время уделяется очень большое внимание изучению этих соединений, так как полициклические соединения и, особенно, 3,4-бенз-пирен обладают канцерогенными свойствами. Чувствительность метода 10^–3 мкг 3,4-бензпирена в 1 кг продукта.

Люминесцентный анализ широко применяется для идентификации компонентов, получающихся при хроматографии. Так, свечение продуктов реакции фосфолипидов с родамином используется для идентификации фосфатидных фракций при их бумажной и тонкослойной хроматографии. Высокая чувствительность люминесцентных индикаторов позволяет использовать их при титровании очень разбавленных растворов мутных или окрашенных сред. Титрование проводят в темном помещении при освещении пробы с помощью ультрафиолетового осветителя с фильтром, поглощающим видимый свет.

8.4. Цвет и его измерение

8.4.1.Общие понятия и приемы измерения цвета

В практической работе бывает необходимо характеризовать окрашенные тела по их цветовым свойствам. При этом общепринятое употребление термина «цвет» часто означает характеристику видимого светового потока, попадающего в глаз, по его цветовому качеству. В колориметрии термин «цвет» употребляется для обозначения видимого светового потока не только по его цветовому качеству, но и по величине или яркости. Для обозначения качественного цветового различия двух потоков, без учета их величин, правильнее применять термин «цветность». Поэтому полная характеристика цвета складывается из его яркости (количественная характеристика) и цветности (качественная характеристика).

Определение цвета неразрывно связано с физиологическими особенностями восприятия цвета человеком. Глаз человека способен воспринимать излучение с длинами волн в пределах 390…760 нм. Цвет монохроматического излучения определяется значением соответствующей ему длины волны и его яркостью или энергией. Однако в обычных условиях жизни цветовые ощущения вызываются не монохроматическими лучами, а сложной совокупностью лучей различных длин волн, испускаемых или отражаемых каждым телом.

Следовательно, цветовые свойства тела определяются спектральным составом светового потока, т. е. зависят от состава излучения и относительной интенсивности лучей различных длин волн, составляющих его спектр.

При этом результирующий цвет обусловлен законами смешения цветов, происходящего при одновременном попадании в глаз лучей различных длин волн. При восприятии глазом всех световых лучей, составляющих спектр Солнца, получается впечатление белого цвета. Все окрашенные тела должны обладать неодинаковым (избирательным) отражением или поглощением лучей, составляющих белый цвет. В этом случае меняется состав попадающего в глаз светового потока, а следовательно, и результирующий цвет. Следует подчеркнуть, что спектральная характеристика однозначно связана с цветом, но по цвету нельзя точно установить спектральный состав излучения. Например, белый солнечный цвет и белый цвет, полученный от смешения только двух дополнительных цветов, могут быть для глаза совершенно тождественными.

На основании изученных свойств глаза воспринимать потоки того или иного спектрального состава была установлена возможность получения всего многообразия цветовых тонов, видимых глазом, путем смешения трех основных цветов в соответствующих пропорциях.Из этого факта вытекает возможность характеризовать любой цвет тремя числами, тремя координатами. Для оценки спектральных цветов, выбранных в качестве основных (красного Х, зеленого У, синего Z устанавливаются некоторые произвольные единицы. Указание количества основных цветов в смеси однозначно характеризует результирующий цвет. Изменение этих чисел в одном и том же отношении меняет лишь яркость цвета, т. е. его количество, но не качество. Цветность при этом не меняется. Таким образом, цвет (его яркость и цветность) однозначно определяется трехцветными координатами Х, Y, Z при определенном источнике света. Любая точка на цветовом графике характеризуется трехцветными коэффициентами, которые зависят от количества и качества основных цветов, составляющих результирующий цвет, и численно равны:

х = ; у = ; z = . (8.6)

При этом в качестве источника принят источник равноинтенсивного излучения Е. Его цветности соответствуют х= у = 1/3.

Таким образом, задача измерения цвета сводится к определению величин Х, Y, Z. Обычно для их измерения используют колориметры – приборы со строго стандартизованными фильтрами и источником света.

Кроме источника Е, пользуются источниками белого цвета А, В, С. Источник А – отградуированная лампа накаливания, нить которой имеет цветовую температуру 2854 К, она соответствует условиям вечернего освещения. Источники В и С представляют собой лампы накаливания со специальными фильтрами, выделяющими излучение, эквивалентное по составу источникам с цветовой температурой 4800 К (В) и 6500 К (С). При определении цвета всегда указывают тип источника, так как в зависимости от него распределение цветов на цветовом графике несколько меняется.

Принцип действия визуальных колориметров основан на сравнении цвета двух половин поля зрения, одна из них освещена излучением, цвет которого изменяется, а другая служит для сравнения.

Различают два типа приборов. В колориметрах первого типа измерение цвета сводится к получению цвета, неотличимого от измеряемого, путем смешения определенного количества трех основных цветов и последовательного вычитания определенного количества трех основных цветов из состава белого цвета. К этому типу относится большая часть визуальных колориметров.

Примером второго типа колориметров является трехцветный объективный колориметр, в котором в качестве приемников выбирается такая комбинация трех фотоэлементов и фильтров, чтобы каждый фотоэлемент давал фототоки, пропорциональные координатам цвета Х, Y, Z. Фототоки суммируются, и результирующий цвет представляется на экране осциллографа точкой с координатами цветности х, у. Объективные колориметры достаточно сложны, и при массовом анализе целесообразнее использовать фотоэлектрические компараторы цвета, действие которых основано на измерении отклонений в цвете от цвета стандарта. Они также снабжены строго стандартизованными фильтрами, выделяющими потоки основных цветов: красного, синего, зеленого. Результаты измерения также представляются в виде значений координат цветности х, у .

Кроме непосредственного измерения цвета, в практической работе часто возникает потребность в контроле цвета производственных проб. Эта задача является наиболее простой и может быть решена путем сравнения цветности пробы с цветом эталона. При этом основное внимание должно быть уделено выбору эталона и стандартизации условий освещения.

В качестве эталона выбирают твердое или жидкое тело, имеющее спектральную характеристику, аналогичную или очень близкую к характеристике анализируемой пробы. Только при этом условии для всех наблюдателей и при любых условиях освещения цвет эталона будет совпадать с цветом пробы. При некотором различии в спектральных кривых однозначность оценки цвета разными наблюдателями может нарушаться даже при одинаковых условиях освещения.

При определении цветности ряда пищевых продуктов используется йодная шкала. Однако различие в спектрах продукта и растворов йода часто затрудняет проведение анализа, несмотря на то, что сравнение проб с эталоном проводят при толщине слоя продукта 1 см для уменьшения влияния пигментов группы хлорофилла.

При визуальном наблюдении различие в спектрах эталона и пробы приводит к появлению различия в цветовых оттенках и невозможности проведения точной оценки цветности. Применение в таких случаях фотоэлектрического прибора может привести, благодаря его чувствительности, к еще более ошибочным результатам.

8.4.2. Методики определения цветности пищевых продуктов

Определение цветного числа масел. Цветное число растительного масла указывает, сколько миллиграммов свободного йода содержится в 100 мл водного раствора йода, имеющего одинаковый цвет с исследуемым маслом при толщине слоя масла 10 мм.

Цветное число можно определять двумя методами:

– сравнением окраски профильтрованного масла с цветной шкалой стандартных водных растворов йода в йодистом калии, заключенных в запаянные пробники из бесцветного стекла с внутренним диаметром 10 мм;

– сравнением окраски профильтрованного масла с окраской йодного раствора в колориметре.

Определение цветного числа масла по шкале стандартных растворов йода. Стандартные водные растворы йода готовят следующим образом: одну часть дважды возогнанного йода (0,24…0,26 г) и две части йодистого калия (0,50 г) отвешивают в стаканчик с притертой пробкой и растворяют примерно в 10 мл дистиллированной воды; раствор переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и постепенно доливают водой до метки. Титр раствора устанавливают по 0,01 н. раствору тиосульфата натрия. К части этого раствора прибавляют дистиллированную воду в таком количестве, чтобы в 100 мл стандартного раствора А содержалось точно 100 мг йода. Серию растворов с различным содержанием йода готовят в соответствии с данными табл. 8.2, наливая в пробирки определенные объемы стандартного раствора и воды. Необходимое количество стандартного раствора и воды отмеряют градуированными пипетками но 10 мл или бюретками. Затем пробирки осторожно запаивают в узкой части и отмечают на них лаком или восковым карандашом концентрацию водного раствора, выраженную в миллиграммах йода в 100 мл раствора.

Йодные эталоны должны храниться в темном месте и проверяться через каждые шесть месяцев.

Пробирки перед наполнением необходимо прокипятить в 10 %-м растворе соляной кислоты, тщательно промыть и просушить.

Проведение анализа. В пробирку диаметра 10 мм наливают профильтрованное исследуемое растительное масло и сравнивают интенсивность окраски масла с окраской стандартных растворов. Исследование производят при температуре 20 °С в проходящем и отраженном дневном свете либо (в темное время года) при свете матовой электрической лампочки.

Таблица 8.2

Приготовление серии растворов йода

Цветное число исследуемого масла будет равно цветному числу эталона, дающего при сравнении одинаковую окраску.

Определение цветного числа масел с применением концентрационных колориметров. Колориметрический метод основан на вытекающем из закона Бургера–Ламберта–Бера положении о том, что для двух растворов одного и того же вещества с одинаковой интенсивностью окраски и разной толщиной слоев концентрации этих растворов обратно пропорциональны толщине их слоев. Зная толщину слоя и концентрацию одного раствора и определив толщину слоя другого раствора, можно вычислить концентрацию последнего. Интенсивность окраски растворов сравнивают в проходящем свете в визуальных приборах любого типа.

Меняя толщину слоя, т. е. опуская или поднимая стеклянные столбики (в некоторых приборах – перемещая стаканы относительно неподвижных столбиков), можно уровнять интенсивность окраски полей. Измерения обычно производят при толщине слоя не менее 5 и не более 30 мм.

Стандартным раствором при определении цветного числа масла служит водный раствор йода; его наливают в один стакан. В другой наливают масло, оставляя при этом толщину слоя масла постоянной (10 мм). Меняя толщину слоя стандартного раствора, уравнивают интенсивность окраски полей. Измерения повторяют несколько раз.

Определение цветности масел при помощи цветомеров. Измерение цветности масел при помощи цветомеров (с осветителем) осуществляют методом сравнения. При этом одна половина поля зрения окуляра, освещенная световым потоком, проходящим через слой масла, сравнивается по цвету с другой половиной поля зрения, которая может освещаться световым потоком переменной цветности. Изменение цветности последнего достигается при помощи набора светофильтров, выделяющих световые потоки определенной величины и цвета. Величина светового потока и его цветность измеряются в условных цветовых единицах.