Принцип действия фотометров типа ФМ-56, ФМ-57, ФМ-58 основан на выравнивании световых потоков, проходящих через стандартное и анализируемое вещества (или их растворы), при помощи измерительных диафрагм. При равной освещенности обеих половин поля зрения окуляра справедливо (при условии выполнения основного закона поглощения) соотношение:

С_х = С_ст , (8.2)

где С_ст – концентрация стандартного раствора; D_х и D_ст – оптические плотности анализируемого и стандартного растворов.

Приборы снабжены двумя наборами светофильтров, один из которых содержит три широкополосных фильтра, второй – восемь фильтров, выделяющих участки видимого спектра шириной около 40 нм. Набор стеклянных кювет позволяет проводить измерения при толщине слоя 1; 10 и 50 мм. При проведении серийных анализов на этих приборах целесообразно пользоваться градировочным графиком, построенным в координатах оптическая плотность D – концентрация С на основании результатов измерения стандартных растворов различной концентрации, изменяющейся в требуемом для анализа интервале. Оптическая плотность растворов должна быть в пределах 0,15…0,85.

8.2. Фотоэлектрический метод

В фотоэлектрических колориметрах регистрация световых потоков производится фотоэлементами различных типов. Чаще всего они используются в дифференциальной схеме. Наиболее широко распространены фотоколориметры ФЭК-М, ФЭК-Н-54, ФЭК-Н-57, ФЭК-56.

Принципиальная схема фотоэлектрокалориметра изображена на рис. 8.1. Для измерения оптической плотности (коэффициента пропускания) в фотоэлектрокалориметре премниками световой энергии служат два фотоэлемента 3, а в качестве нуль-прибора используется индикаторная лампа 1.

Р ис. 8.1. Схема фотоэлектрокалориметра ФЭК-56:

1– источник света; 2 – измерительная диафрагма; 3 – фотоэлементы; 4 – компенсационная диафрагма; 5 – кюветы; 6 – призма; 7 – светофильтр

При работе на фотоэлектрокалориметрах используют три кюветы: в две из них наливают раствор сравнения, в третью – анализируемый раствор. Сначала на пути световых потоков ставят кюветы с растворами сравнения, уравнивают интенсивность световых потоков (по нулю измерительного прибора), затем в правый поток вводят кювету с анализируемым раствором. Вследствие поглощения части светового потока исследуемым раствором на фотоэлемент будет падать световой поток меньшей интенсивности, чем на фотоэлемент, на который падает световой поток, проходящий через раствор сравнения. Уравнивание световых потоков достигается использованием компенсационной диафрагмы, связанной со шкалой прибора, по которой и производят отсчет величины поглощения (оптической плотности или коэффициента пропускания).

На пути светового потока в фотоэлектрокалориметрах ставят светофильтры, которые пропускают часть спектра. Светофильтры имеют определенную полосу пропускания и применяются для выделения области спектра, максимально поглощаемой веществом. Этим достигается большая точность определений. Светофильтр подбирают экспериментально на основании измерения величины поглощения света исследуемого раствора при разных светофильтрах или по данным табл. 8.1. Например, при фотометрировании растворов с желтой окраской используют синий светофильтр, поскольку растворы желтого цвета поглощают синюю часть спектра.

Таблица 8.1

Характеристика светофильтров спектрофотометров фэк-56

Точность фотометрических определений зависит от правильно выбранных светофильтров и кюветы. Это сочетание должно быть таким, чтобы ошибка была минимальной. Если анализируется интенсивно окрашенный раствор, то следует пользоваться кюветой с малой рабочей длиной (10 мм), при работе со слабоокрашенным раствором необходимо применять кюветы с большой рабочей длиной (30...50 мм).

Наибольшая точность фотометрических измерений достигается при значении D = 0,435 (соответственно Т = 36,8 %). Поэтому при фотометрических измерениях необходимо стремиться к тому, чтобы величина оптической плотности исследуемого раствора была близка к значению 0,4 или, во всяком случае, лежала в интервале 0,12…1,0, что позволяет определять концентрацию вещества в растворе с воспроизводимостью не ниже 5 %.

При определении цветности продуктов пищевых производств с помощью фотоэлектрокалориметров ее выражают в единицах оптической плотности. В этом случае за единицу цветности условно принимают цветность такого раствора, который при массовой доле 1 г/см³ (соответственно 100 г/100 см³) в кювете длиной 1 см имеет величину оптической плотности, равную единице, т. е.

Ц₀ = , (8.3)

где с – массовая доля раствора, %; l – длина кюветы, см.

Поскольку в этом случае получились бы малые значения, было предложено значение Ц₀ увеличить в 1000 раз, соответственно Ц = 1000 D/сl. Выражая массовую долю раствора через содержание в нем сухих веществ (СВ), получаем

с = или Ц = 100 , (8.4)

которая выражается в единицах оптической плотности на 100 г сухих веществ.

Для перевода величины цветности в единицах оптической плотности в условные единицы ее необходимо разделить на переводной коэффициент, который для различных веществ может быть разным. Так, согласно П.М. Силину, переводной коэффициент для растворов сахара-песка ра- вен 115.

Фотоколориметрический анализ обладает высокой чувствительностью (до 10^–7 моль/дм³), воспроизводимостью, избирательностью, простотой выполнения, дешевизной аппаратуры, благодаря чему он находит все более широкое применение для контроля пищевых продуктов, не только их цветности, но и концентрации разных соединений.

8.3. Люминесцентный анализ

Некоторые вещества обладают свойством люминесцировать, т. е. отдавать в виде излучения поглощенную ими энергию. По способу возбуждения свечения различают несколько типов люминесценции:

– фотолюминесценцию, вызываемую поглощением света; если при удалении источника возбуждения свечение прекращается, то это явление называется флуоресценцией, а явление, связанное с аккумулированием световой энергии и постепенным ее освобождением в виде излучения получило название фосфоресценции;

– люминесценцию, вызываемую ударами быстрых заряженных частиц или ионов (рентгено-, катодо-, радиолюминесценция);

– хемилюминесценцию – свечение, возбуждаемое за счет энергии, освобождающейся при химической реакции.

При анализе органических соединений наибольший интерес представляет фотолюминесценция и ее основной вид – флуоресценция.

Явление флуоресценции подчиняется ряду правил. Спектр флуоресценции смещен по сравнению со спектром поглощения в сторону больших длин волн. Это значит, что энергия излучаемого веществом света Е_ф всегда меньше энергии поглощенного света Е_п, возбуждающего свечение (правило Стокса). Таким образом, вещества, поглощающие зеленый свет, не могут флуоресцировать синим или фиолетовым светом, а только желтым или красным; ультрафиолетовая радиация может вызвать флуоресценцию любого цвета.

При одинаковом цвете люминесценции веществ может наблюдаться различие в спектре, так как распределение энергии по длинам волн или частоты является характерным (при данных условиях измерения) для каждого вещества. Более того, было установлено, что спектр люминесценции не зависит от длины волны возбуждающего света, пока Е_п > Е_ф. Поэтому в практической работе для возбуждения флуоресценции обычно пользуются широкими спектральными интервалами, выделяемыми из общего потока источника ультрафиолетового излучения специальными фильтрами.

Важной величиной для количественного анализа является энергетический выход флуоресценции:

ρ = . (8.5)

Он растет пропорционально длине волны возбуждающего света почти до области наложения спектров поглощения и люминесценции, а затем резко падает (правило Вавилова). Выход флуоресценции существенно зависит от условий измерения: концентрации, рН раствора и наличия посторонних веществ.

Тушение флуоресценции характерно для многих веществ при повышенных температурах. Это явление может быть вызвано молекулами флуоресцирующего вещества при взаимодействии с молекулами тушителя, к которым относятся соли галогенов, бисульфит и тиосульфат натрия, перманганат калия, аналин, фенол, резорцин, растворенный кислород и др. При этом эффект тушения зависит от вязкости раствора и наблюдается при достаточно высоких концентрациях тушителя (10^–7 моль/л).

Выход флуоресценции очень зависит от рН среды. Общие закономерности этого не установлены. Изменение выхода флуоресценции у некоторых веществ, относящихся к группе флуоресцентных индикаторов, свечение может возникать лишь в определенных пределах рН.

8.3.1. Техника эксперимента и общие приемы анализа

Рассмотрим принципиальные схемы для возбуждения и наблюдения флуоресценции (рис. 8.2). Источник света 1 проходит через светофильтр 2 и направляется кварцевым конденсором 3 на кварцевую кювету с образ- цом 4. Свет флуоресценции направляется стеклянным конденсором 5 на приемник 6. Приемником могут служить глаз (визуальный метод регистрации), фотопластинка или фотометр (объективные методы регистрации). При наблюдении спектров перед приемником ставят спектральный прибор. Наиболее часто используется схема, в которой возбуждающий свет направляется под углом 45° к поверхности кюветы. Если анализируемое вещество не сильно поглощает возбуждающий свет, то можно направлять луч вдоль передней стенки кюветы.

4 5 6 4 5 6

3

3

2 1 2

1

Рис. 8.2. Принципиальная схема флуорометра:

1 – источник освещения; 2 – светофильтр; 3, 5 – конденсоры; 4 – кювета с исследуемым веществом; 6 – приемник

При количественном анализе измерения выхода флуоресценции обычно не производят, а пользуются методом сравнения интенсивности свечения анализируемого вещества с интенсивностью свечения стандартного раствора. Эти измерения удобнее производить при помощи флуорометров, построенных по двулучевой схеме.

Люминесцентный анализ можно проводить: по измерению интенсивности свечения и по изменению степени тушения флуоресценции вещества при добавлении определенного количества тушителя.

При количественном анализе в обоих случаях выбирают оптимальные условия для наблюдения флуоресценции, устанавливают интервал концентраций, в котором выход флуоресценции линейно зависит от концентрации, и составляют градировочную кривую на основании результатов измерения флуоресценции стандартных растворов анализируемого вещества.

8.3.2. Применение люминесцентного анализа в исследовании пищевых продуктов

Каротиноиды обладают флуоресценцией желто-зеленого цвета. Это свойство обычно используют при идентификации хроматограмм.

Пигменты группы хлорофилла обладают интенсивной флуоресценцией темно-красного цвета. В чистых и сухих органических растворителях они флуоресцируют слабо. Флуоресценция резко усиливается при наличии воды, спирта, аминов. По спектру флуоресценции можно определить присутствие ≈ 1 мкг/л хлорофилла. Водорастворимые производные по флуоресценции мало отличаются от хлорофилла.

Свободные формы токоферолов интенсивно флуоресцируют в ультрафиолетовой области при длине волны 340 нм под влиянием возбуждающего света с длиной волны 295 нм. Связанные формы токоферолов можно перевести в свободные обработкой пробы LiАlН₄. Выход флуоресценции α-, β- и δ-токоферолов (в расчете на моль вещества) меняется так же, как и их молярные коэффициенты поглощения. Чувствительность метода около 0,005 мкг/мл. Присутствие витамина А не мешает определению токоферола.