Автореферат: Алгоритмы дифференциальной диагностики наследственных болезней обмена веществ, сопровождающихся нарушениями метаболизма аминокислот и ацилкарнитинов

ВЭЖХ-МС/МС органических кислот мочи

Анализ концентраций сукцинилацетона, глутаровой и оротовой кислот в моче проводили на хроматографе Agilent 1200 (Agilent Technologies, США), на колонке 100Х2,1 мм 5 мкм “Hypersil GOLD C18” (Thermo scientific, США) с детектированием на квадрупольном тандемном масс-спектрометре AB Sciex API 3200 QTrap (AB Sciex, США) с ионизацией в электроспрее методом построения калибровочной кривой. Состав и скорость растворителей, а также условия детектирования подбирались экспериментально.

Газовая хроматография - масс-спектрометрия органических кислот мочи.

Газовая хроматография - масс-спектрометрия выполнена на приборе 7890А/5975С (Agilent Technologies, США), колонка HP-5MS (30м*0,25мм*4 мкм). Концентрация органических кислот в моче определялась в виде триметилсилиловых эфиров. Расчет полученных результатов осуществлялся методом внутреннего стандарта.

Определение активности биотинидазы

Активность биотинидазы определялась в сыворотке крови колориметрическим методом на спектрофотометре Spectronic Genesys 5 (Thermo Spectronic Instruments, США) при 550 нм (Wolf B. et al, 1983).

Молекулярно-генетические методы исследования.

Геномную ДНК из цельной крови и пятен крови на фильтрах выделяли, используя набор реактивов Diatom DNA Prep (ООО Биоком, Россия) по методике, рекомендованной изготовителем. Полимеразную цепную реакцию, рестрикционный анализ и электрофорез проводили стандартными методами (Sambrook J. et al., 1989). Для каждой пары праймеров подобраны условия, отличающиеся необходимой температурой отжига праймеров и концентрацией MgCl₂. Для анализа частых мутаций использованы эндонуклеазы рестрикции MspI, Bsp19I, PstI, AcuI, Bsp1720I и Tru 9I (“СибЭнзим”, Россия). Секвенирование ПЦР-фрагментов с целью выявления редких мутаций проведено согласно протоколу фирмы производителя на приборах ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) (Лаборатория ДНК-диагностики ФГБУ “МГНЦ” РАМН, Заведующий - д.б.н. Поляков А.В.) и ABI Prism 3500 (Applied Biosystems).

Методы статистического анализа.

Оценку статистической значимости результатов проводили с использованием методов параметрической и непараметрической статистики для множественных сравнений. Анализу данных предшествовала проверка распределений значений показателей на соответствие их критериям “нормальности”. В случае нормального распределения применяли однофакторный дисперсионный анализ ANOVA или ANOVA для повторных измерений, в противном случае - критерий Крускала-Уоллиса и/или критерий Ньюмана-Кейлса. Обработку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения Excel 2000, Statistica for Windows 6.0.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Сравнение разных возрастных групп

Согласно критериям развития ребенка, принятыми в педиатрии (Педиатрия, национальное руководство, 2009) контрольная выборка для определения референсных границ (n=3572) разделена на восемь возрастных групп и проведено исследование 20 аминокислот и 32 ацилкарнитинов:

1 группа - новорожденные (по 7 день жизни, n=441),

2 группа - неонатальный период (до 1 месяца, n=165),

3 группа - грудное вскармливание (от 1 до 6 месяцев, n=386),

4 группа - ввод прикорма (от 6 месяцев до 1 года, n=547),

5 группа - раннее детство (от 1 до 3 лет, n=713),

6 группа - дошкольный период (от 3 до 7 лет, n=687),

7 группа - младший школьный период (от 7 до 12 лет, n=451),

8 группа - подростковый период (от 12 до 16 лет, n=182).

Оценка межгрупповых различий с использованием критерия Ньюмана-Кейлса показала, что по некоторым исследуемым метаболитам возрастные группы достоверно отличаются друг от друга (р<0,01). Наибольшие различия при количественном анализе аминокислот наблюдаются в группе новорожденных по сравнению с другими группами. Так в этой группе концентрация незаменимых аминокислот (лейцин, метионин, фенилаланин, валин) достоверно выше, а аминокислоты, участвующие в цикле мочевины, достоверно снижены (орнитин, цитруллин, аргинин, аспарагиновая кислота) по сравнению с другими группами.

С целью решения вопроса о необходимости применения разных референсных значений для разного пола, была проведена оценка исследуемых групп с помощью критерия Манна-Уитни, которая не показала достоверных отличий по полу ни в общей выборке, ни в каждой возрастной группе отдельно.

Поскольку при анализе межгрупповых различий не выявилось достоверных различий между группами по многим исследуемым параметрам, проведен классический кластерный анализ К-средних и иерархический кластерный анализ (рис.1.), которые позволили перегруппировать исследуемую выборку на 3 группы:

Группа 1 - новорожденные (n=441)

Группа 2 - дети от 8 дней до 6 месяцев жизни (n=551)

Группа 3 - от 6 месяцев и старше (n=2580).

Дальнейшие этапы исследования проведены в вышеперечисленных трех возрастных группах.

Таким образом, проведенный анализ позволяет сделать следующее заключение - измеряемые метаболиты имеют возрастные особенности, поэтому при определении референсных значений следует это учитывать, что имеет важное значение при проведении селективного скрининга на НБО.

Определение референсных значений

Поскольку в России впервые применялся МС/МС анализ для выявления аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов митохондриального в-окисления в первую очередь стояла задача определить референсные значения измеряемых метаболитов.

Рис.1. Иерархическая классификация для 8 возрастных групп.

Для всей выборки кроме новорожденных не применялся принцип безотборного формирования. Для НБО такой подход вполне оправдан, поскольку при большинстве из них наблюдаются значительные изменения в концентрациях одного или нескольких метаболитов, в десятки раз, превышающие нормальные значения. Такой принцип формирования референсных значений принят в стандартной лабораторной практике, когда в качестве референсных значений лабораторных показателей наиболее часто используют границы, найденные методом персентилей (Гланц С., 1998). Разные авторы применяют различные методы определения референсных границ, чаще всего 99,5% (0,5%) персентиль (Rashed M.S. et al, 1997; Schulze A. et al, 2003; Wilcken B. et al., 2001), иногда значение концентраций соответствующих среднему значение плюс 4 или 5 стандартных отклонений (Hoffman G. et al., 2001; Zytkovicz T.H. et al., 2001).

В данном исследовании в качестве возрастных референсных границ использован наиболее принятый метод оценки значений концентраций метаболитов, соответствующие 0,5% и 99,5% персентилям.

Спектр аминокислот и ацилкарнитинов при патологии.

Всего с января 2004 по октябрь 2011 года обследовано 8615 пациентов. Среди них новорожденных - 519, детей в возрасте от 8 дней до 6 месяцев - 1663, старше 6 месяцев - 6433. Подавляющее число пациентов поступило из отделений психоневрологии - 6091 (71%), меньше из отделений гастроэнтерологии/инфекций - 2005 (23%) и только 6% пациентов (519 человек) поступило из отделений патологии новорожденных.

У 357 пациентов (4% от общего числа) выявлено отклонение в концентрациях измеренных метаболитов. Большинство изменений выявлены в спектре ацилкарнитинов - 59,4%, меньше среди аминокислот - 31,5%, в 9,1% случаев изменения наблюдались в спектре как аминокислот, так и ацилкарнитинов. Среди изменений спектра аминокислот следует отметить повышение концентрации аланина, что обнаружено у пациентов с лактат-ацидозом (n=32), и повышение тирозина и/или метионина, которое выявлено у 123 больных с поражением печени разной этиологии.

Высокий процент ложноположительных результатов при анализе ацилкарнитинов, безусловно связан с особенностями обследованного контингента пациентов - практически все они получают терапию, в том числе лекарственные средства, которые при МС/МС анализе могут образовывать пики с m/z, сходным с m/z диагностически значимых ацилкарнитиинов, как например, препараты вальпроевой кислоты, витамины, жировые эмульсии и т.д. (Moreno F.A. et al, 2005).

После проведения дополнительных исследований, которые включали определение концентрации ацилкарнитинов в плазме крови, определение органических кислот мочи методом ГХ/МС, исследование активности ферментов и ДНК-диагностики диагноз НБО был подтвержден у 139 пациентов, что составило 39% от общего числа пациентов с выявленными изменениями в спектре аминокислот и ацилкарнитинов и 1,6% от общей выборки пациентов. Из них у 57 (в том числе ФКУ - 23) выявлены нарушения обмена аминокислот (АА), у 56 - органические ацидурии (ОА), у 26 - дефекты окисления жирных кислот (ДОЖК).

При сравнении результатов селективного скрининга (рис.2.) можно отметить следующие особенности: среди пациентов из отделений патологии новорожденных превалировали аминоацидопатии с ранним началом и острым течением из группы нарушений цикла мочевины.

Рис.2. Спектр патологий среди пациентов из отделений разного профиля.

Подавляющее большинство пациентов с ОА из отделений гастроэнтерологии и инфекции составляли пациенты с метилмалоновой ацидурией (ММА), в то время как все пациенты с глутаровой ацидурией тип 1 (ГА1) и недостаточностью биотинидазы (НБ) поступили из отделений психоневрологии (рис.3.). Среди пациентов с ДОЖК, поступивших из отделений гастроэнтерологии и инфекции 69% составили пациенты с недостаточностью ДЦГАД (рис.4.).

Рис.3. Спектр органических ацидурий среди пациентов из отделений разного профиля.

Рис.4. Спектр нарушений митохондриального в-окисления среди пациентов из отделений гастроэнтерологии и инфекции.

Нарушения обмена аминокислот

Методом МС/МС возможно определять более 20 различных аминокислот, изменение концентрации которых является маркером разных форм аминоацидопатий - тирозинемии, нарушений цикла мочевины, лейциноза, ФКУ, гомоцистинурии. Следует отметить, что далеко не во всех случаях измерение концентрации аминокислот достаточно для точного установления диагноза. Определение отрезной точки (cut-off) для каждого анализируемого соединения всегда является определенным компромиссом между высокой чувствительностью и поддержанием ложно-отрицательных результатов на низком уровне.

Значения концентраций диагностически значимых метаболитов приведены в таблице 1. Концентрации этих метаболитов статистически достоверно отличается от контрольной выборки и согласуется с данными литературы. Поскольку число выявленных случаев было невелико, провести другую дополнительную оценку значений показателей не представлялось возможным.

Органические ацидурии

Довольно большое число заболеваний, связанных с повышением уровня органических кислот (органические ацидурии) возможно диагностировать с помощью МС/МС анализа. Метилмалоновая, пропионовая и изовалериановая ацидурии имеют характерные изменения при МС/МС. При глутаровой ацидурии глутарилкарнитин (C5DC), может иметь пограничные значения, особенно если образцы взяты у ребенка в возрасте 7 и более дней.

Значения концентраций диагностически значимых метаболитов приведены в таблице 2.

Таблица 1. Значения концентраций диагностически значимых метаболитов в группе аминоацидопатий

Таблица 2. Значения концентраций диагностически значимых метаболитов в группе органических ацидурий