Автореферат: Алгоритмы дифференциальной диагностики наследственных болезней обмена веществ, сопровождающихся нарушениями метаболизма аминокислот и ацилкарнитинов

Таблица 9. Частые мутации для некоторых заболеваний.

Несмотря на небольшой размер выборок, расширены представления о спектре мутаций для некоторых заболеваний, выявленных в ходе исследования (рисунок 5). Всего в ходе исследования разработаны методы ДНК-диагностики для 12 заболеваний из этой группы (таблица 10), выявлено 24 новых мутаций и 33 описанных ранее в литературе.

а) тирозинемия тип 1 б) глутаровая ацидурия тип 1

Рис.5. Спектр мутаций у пациентов.

Таблица 10. Заболевания, для которых в ходе исследования разработаны методы ДНК-диагностики.

Частота длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот

Поскольку в ходе исследования из 26 пациентов c ДОЖК, 15 пациентов было с недостаточностью ДЦГАД и только 5 с недостаточностью СЦАД, а по данным литературы недостаточность СЦАД является самым частым заболеванием из группы ДОЖК, и среди пациентов с недостаточностью ДЦГАД и СЦАД с высокой частотой встретились мутации Glu474Gln и Lys304Glu (83,3 % и 70%, соответственно), проведено определение частоты данных мутаций методом ПЦР-ПДРФ анализа среди новорожденных г. Москвы. На основании анализа частот мутаций Glu474Gln и Lys304Glu в выборке новорожденных г.Москвы выявлено, что частота СЦАД в России значительно ниже, чем во многих других странах Западной Европы, а частота ДЦГАД сравнима с частотами некоторых стран Западной Европы (таблица 11).

Таблица 11. Анализ частот мутаций Glu474Gln и Lys304Glu в выборке новорожденных г.Москвы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тандемная масс-спектрометрия - новая перспективная технология просеивающих программ на НБО, которая уже многие годы широко применяется во многих странах мира. Далеко не все заболевания, выявляемые методом МС/МС, подходят под критерии, которые разработаны для неонатального скрининга. Некоторые из них относятся к числу чрезвычайно редких, другие не поддаются эффективному лечению, для ряда заболеваний не показана высокая чувствительность метода, что не позволяет избежать ложно-отрицательных результатов скринирования. Кроме того, большое число разнообразных заболеваний, на которые проводится исследование, значительно усложняет процедуру подтверждающей диагностики. Подтверждающие тесты, которые применяются для этих групп болезней, включают: дополнительное определение различных метаболитов методом ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС, определение активности ферментов, молекулярно-генетическое тестирование.

При всем этом преимущества данной технологии неоспоримы - без дополнительных временных и финансовых затрат проводится одновременное определение нескольких десятков разных метаболитов, характеризующих около 35 разных НБО, диагноз некоторых из них на ранней стадии болезни дает возможность начать лечение и предотвратить тяжелые последствия для жизни и здоровья пациента. Поэтому вопрос о включении новых заболеваний в программу массового скрининга сложный, требующий отдельной проработки и соответствующих решений. Но для программ селективного скрининга данный метод может уже сейчас применяться и довольно успешно.

В Российской Федерации все в большем числе центров появилась возможность применения этого метода для выявления НБО и проведения биохимического контроля за диетотерапией. Именно поэтому, одной из основных задач данного исследования являлась оптимизация проведения обследования на НБО (селективного скрининга) методом МС/МС. В ходе проведенного исследования получены собственные данные по количественным характеристикам аминокислот и ацилкарнитинов в норме, впервые в практике отечественной медицины лабораторно подтверждены некоторые редкие формы НБО (недостаточность митохондриальной кетотиолазы). В ходе реализации работы проанализировано более 8000 индивидуумов, что позволило получить довольно точные количественные характеристики многих параметров, а также получить новые, диагностически значимые, соотношения, которые можно включить в программы скрининга с использованием МС/МС анализа.

Большое внимание в работе уделено методам подтверждающей диагностики этих заболеваний. В рамках данного исследования дополнительно разработаны методы подтверждающей биохимической диагностики: нарушений цикла мочевины (определение оротовой кислоты в моче), глутаровой ацидурии тип 1 (определение глутаровой кислоты в моче), определение активности биотинидазы в плазме/сыворотке крови, разработаны простые и быстрые методы ДНК-диагностики для выявления частых мутаций при глутаровой ацидурии тип1, тирозинемии тип 1, недостаточности СЦАД и ДЦГАД.

Отдельным направлением работы явилась молекулярно-генетическая характеристика заболеваний, выявленных у наибольшего числа пациентов. Несмотря на небольшой размер выборок расширены представления о спектре мутаций при метилмалоновой ацидурии, тирозинемии тип 1, лейцинозе, недостаточности орнитинтранскарбамилазы. Выявлено 24 новых мутаций и 33 описанных ранее в литературе. Данные молекулярно-генетического исследования имеют большое значение для отягощенных семей, поскольку для проведения пренатальной диагностики, ДНК-исследование является наиболее предпочтительным.

На основании анализа частот мутаций Glu474Gln и Lys304Glu в выборке новорожденных г.Москвы выявлено, что частота СЦАД в России значительно ниже, чем во многих других странах Западной Европы, а частота ДЦГАД сравнима с частотами некоторых стран Западной Европы.

Для нескольких пациентов со сходной характеристикой метаболитов и клинических проявлений проведен поиск мутаций в одном из генов-кандидатов ACAD9, выбранный исходя из предположительного биохимического дефекта. Патогенных мутаций в гене не выявлено, что позволяет исключить его как возможный ген-кандидат при данном нарушении метаболизма длинноцепочечных ацилкарнитинов. Однако, не вызывает сомнений, что некоторые новые формы НБО еще могут быть открыты после более широкого применения МС/МС и тщательного анализа результатов.

Безусловная редкость заболеваний из этой группы НБО не позволяет провести исследования, позволяющие охарактеризовать все варианты НБО из этой группы, разработать статистически обоснованный подход к диагностике всех заболеваний. Большинство рекомендаций по диагностике этой патологии могут быть даны только на основании обобщения данных литературы и собственного опыта. Поскольку данное исследование адресовано, прежде всего, врачам-лаборантам и врачам-генетикам, работающим в медико-генетической службе, которые не имеют пока большого опыта в диагностике этих форм НБО, составлены дифференциально-диагностические таблицы, в которых приведены основные этапы подтверждающей диагностики и рекомендации по интерпретации полученных данных. Разработанные в ходе исследования подходы могут применяться не только для селективного скрининга, но некоторые из них могут быть взяты за основу при подготовке к проведению массового скрининга новорожденных.

ВЫВОДЫ.

1. На основании анализа концентрации аминокислот и ацилкарнитинов в трех возрастных группах выявлено, что имеются существенные межгрупповые различия, поэтому при селективном скрининге на наследственные болезни обмена требуется определение референсных значений для разных возрастных групп.

2. В ходе обследования 8615 пациентов, направленных с предположительным диагнозом наследственные болезни обмена, выявлено 139 (1,6%) пациентов: из них с аминоацидопатиями (в том числе 23 пациента с фенилкетонурией) - 57 пациентов (41%), с органическими ацидуриями - 56 (40%), с дефектами митохондриального в-окисления - 26 (19%). Низкий процент выявленных пациентов указывает на необходимость разработки более четких показаний к селективному скринингу на наследственные болезни обмена данным методом.

3. Анализ соотношений метаболитов позволил определить новые диагностические значимые соотношения для недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы, (С18ОН+С18:1ОН+С16ОН)/С0 и (С6+С8+С10:1)/(С16+С18+С18:1) соответственно, применение которых повышает чувствительность, специфичность и положительную прогностическую ценность метода тандемной масс-спектрометрии для диагностики этих заболеваний.

4. Составлены алгоритмы подтверждающей диагностики для 18 выявленных в ходе исследования форм наследственных болезней обмена, включающие ДНК-диагностику и высокочувствительные методы определения сукцинилацетона, оротовой и глутаровой кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии.

5. При тирозинемии тип 1, глутаровой ацидурии тип 1, недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы выявлены частые мутации (IVS 6-1 G>T, IVS 12+5 G>A, Pro342Leu; Arg402Trp; Glu474Gln; Lys304Glu, соответственно) и разработаны простые, быстрые методы их детекции (ПЦР-ПДРФ анализ). Обнаружены новые мутации: 1 - при тирозинемии тип 1; 7 - при лейцинозе; 6 - при метилмалоновой ацидурии; 2 - при глутаровой ацидурии тип 1; 5 - при недостаточности очень длинноцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы и 1 мутация de novo при недостаточности орнитинтранскарбамилазы.

6. Оценка частот недостаточности среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот и длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот среди новорожденных г.Москвы, рассчитанных из популяционных частот мутации Lys304Glu (0,00126 (0,00000/0,00301, при 95%-ом доверительном интервале), относительная доля мутации 0,70) и Glu474Gln (0,00346 (0,00043/0,00649, при 95%-ом доверительном интервале), относительная доля мутации 0,833) составила 1/279947 и 1/57784, соответственно. Полученная частота длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот выше, а частота среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот гораздо ниже, чем в большинстве стран Западной Европы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Байдакова Г.В., Букина А.М., Гончаров В.М., Шехтер О.В., Букина Т.М., Покровская А.Я., Захарова Е.Ю., Михайлова С.В., Федонюк И.Д., Колпакчи Л.М., Семыкина Л.И., Ильина Е.С. Диагностика наследственных болезней обмена веществ на основе сочетания методов тандемной масс-спектрометрии и энзимодиагностики.// Медицинская генетика. - 2005. - Т.4, № 1. - С.28-33.

2. Михайлова С.В., Ильина Е.С., Захарова Е.Ю., Байдакова Г.В., Бембеева Р.Ц., Шехтер О.В., Захаров С.Ф. Множественная карбоксилазная недостаточность, обусловленная мутациями в гене биотинидазы. // Медицинская генетика. - 2005. - № 2. - C.633-638.

3. Михайлова С.В., Захарова Е.Ю., Бобылова М.Ю., Рассказчикова И.В., Ильина Е.С., Байдакова Г.В., Шехтер О.В., Банин А.В., Брюсова И.Б., Волкова Г.И., Петрухин А.С. Глутаровая ацидурия тип 1: клиника, диагностика и лечение.// Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2007. - Т.107, №10. - С.4-12.

4. Николаева Е.А., Цыганкова П.Г., Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю., Белоусова Е.Д., Шулякова И.В. Симптоматическая эпилепсия как проявление дефицита ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот с очень длинной углеродной цепью.// Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2008. - №3. - С.87-91.

5. Панкратова, Е.В. , Воскобоева Е.Ю., Байдакова Г.В., Захарова Е.Ю. Создание тест-системы для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и б-1-антитрипсина.// Медицинская генетика. - 2010. - №3. - С.34-42.

6. Горбань Т.С., Дегтярева М.В., Бабак О.А., Воронцова Ю.Н., Захарова Е.Ю., Байдакова Г.В., Володин Н.Н. Динамика концентрации карнитина в сыворотке крови у детей с очень низкой массой тела при рождении.// Вопросы практической педиатрии. - 2011. - Т.6, №4. - С.28-32.

Публикации в других изданиях:

7. Захарова Е.Ю., Ильина Е.С., Букина А.М., Букина Т.М., Захаров С.Ф., Михайлова С.В., Федонюк И.Д., Байдакова Г.В., Семыкина Л.И., Колпакчи Л.М., Зайцева М.Н. Результаты проведения селективного скрининга на наследственные болезни обмена веществ среди пациентов психоневрологических отделений.// Второй Всероссийский Конгресс “Современные технологии в педиатрии и детской хирургии”. - Материалы Конгресса. - 2003. - C.141-142.

8. Mikhaylova S.V., Baydakova G.V., Boukina A.M., Boukina T.M., Shechter O.V., Ilina E.S., Zakharova E.Y. Combination of tandem mass spectrometry and lysosomal enzymes analysis-effective tool for selective screening for IEM in neurological clinic.// J. Inherit Metab. Dis. - 2004. - V.27, S.1. - P.3.

9. Mikhaylova S.V., Baydakova G.V., Zakharova E.Y., Il'ina E.S. “First cases of biotinidase deficiency in Russia” //European Journal of Human Genetics. - 2005. - V.13, S.1. - P.386.