Автореферат: Алгоритмы дифференциальной диагностики наследственных болезней обмена веществ, сопровождающихся нарушениями метаболизма аминокислот и ацилкарнитинов

Дефекты митохондриального в-окисления

Анализ ацилкарнитинов и их соотношений позволяет выявлять заболевания, относящиеся к нарушению самого процесса в-окисления, транспорта карнитина и карнитинового цикла. Для некоторых заболеваний из этой группы массовый скрининг выявляет случаи при которых у индивидуума с положительными результатами никогда в течении всей жизни не наблюдаются эпизодов метаболической декомпенсации и каких-либо клинических проявлений. Наиболее показательным примером этих случаев является одно из самых частых нарушений в-окисления - недостаточность СЦАД, частота которой увеличилась почти в два раза после введения скрининга с помощью МС/МС на это заболевание.

Средняя частота нарушений митохондриального в-окисления по данным литературы убывает в следующем порядке: СЦАД > КЦАД > ОДЦАД > ДЦГАД. Довольно интересно, что самое редкое заболевание из этой группы по данным литературы, при селективном скрининге в нашем исследовании оказалось одним из наиболее частых. Можно предложить несколько объяснений, во-первых, что это заболевание действительно встречается чаще, во-вторых, что это связано с особенностями формирования контингента больных на исследование (это в основном дети, имеющие острые метаболические нарушения). Значения концентраций диагностически значимых метаболитов приведены в таблице 3.

Анализ соотношений метаболитов

МС/МС анализ не всегда позволяет однозначно подтвердить диагноз. При некоторых заболеваниях могут повышаться одни и те же метаболиты (ММА и ПА). Кроме того, в ряде случаев значения метаболитов могут иметь пограничные значения. Также некоторые метаболиты могут повышаться вторично, как, например, аланин при лактат-ацидозе или тирозин при нарушениях функции печени различной этиологии.

Таблица 3. Значения концентраций диагностически значимых метаболитов в группе нарушений митохондриального в-окисления.

Поэтому кроме референсных значений, для повышения достоверности результатов диагностики довольно часто прибегают к оценке соотношений различных параметров. В литературе такие соотношения были установлены для ФКУ (Chace D.H. et al., 1998), недостаточности карнитин пальмитоил трансферазы тип 1 (Fingerhut R. et al., 2001) и некоторых других заболеваний. Низкая концентрация свободного карнитина, пул которого истощается вторично при многих из нарушений обмена жирных кислот, в ряде случаев не дает возможность определить точный спектр измененных ацилкарнитинов, поэтому поиск значимых соотношений представляет собой несомненную прогностическую ценность.

Недостаточность ДЦГАД.

В ходе исследования выявлено, что у пациентов с недостаточностью ДЦГАД достоверно повышены концентрации длинноцепочечных 3-гидрокси ацилкарнитинов, кроме того, у 40% обследованных пациентов был снижен свободный карнитин и как следствие концентрация всех ацилкарнитинов. С учетом этих особенностей выведено новое соотношение (С18ОН+С18:1ОН+С16ОН)/С0, которое позволяет повысить не только чувствительность, специфичность, но и положительную прогностическую ценность (таблица 4).

Таблица 4. Чувствительность, специфичность и положительная прогностическая ценность маркеров ДЦГАД.

* : ИО - истинноотрицательные, ЛО - ложноотрицательные, ИП - истинноположительные, ЛП - ложноположительные, ППЦ - положительная прогностическая ценность.

При применении в качестве маркеров только концентраций длинноцепочечных 3-гидрокси-ацилкарнитинов следует особое внимание уделять концентрации свободного карнитина, снижение которого может приводить к снижению концентраций и этих метаболитов, снижая чувствительность и специфичность данных маркеров (таблица 4).

Недостаточность СЦАД

В ходе исследования выявлено, что у пациентов с недостаточностью СЦАД достоверно повышены концентрации среднецепочечных ацилкарнитинов (С8, С6, С10 и С10:1). Также найдено, что у этих пациентов снижаются концентрации некоторых длинноцепочечных ацилкарнитинов (С16, С18, С18:1). С биохимической точки зрения это, вероятно, связано с тем, что пул длинноцепочечных ацилкарнитинов истощается, за счет повышения активности митохондриального в-окисления жирных кислот, ферменты которого регулируется различными промежуточными и конечными метаболитами, например, повышение соотношения NADH/NAD+ и ацетил-КoA/КoA приводит к подавлению в-окисления жирных кислот, снижение, наоборот, к повышению активности ферментов, участвующих в этом метаболическом процессе. На основании полученных данных выведено соотношение: (С6+С8+С10:1)/(С16+С18+С18:1), повышающее чувствительность, специфичность и положительную прогностическую ценность анализа (таблица 5).

Таблица 5. Чувствительность, специфичность и положительная прогностическая ценность маркеров СЦАД.

* : ИО - истинноотрицательные, ЛО - ложноотрицательные, ИП - истинноположительные, ЛП - ложноположительные, ППЦ - положительная прогностическая ценность.

Использование в качестве диагностических маркеров только значения концентраций среднецепочечных ацилкарнитинов (С6, С8, С10, С10:1) может давать ложноположительные результаты, в то время, как использование выведенного соотношения снижает их число.

Из таблиц 4 и 5 следует, что наибольшей чувствительностью и специфичностью обладают именно соотношения, а не измеряемые метаболиты, что говорит о необходимости включения диагностически значимых соотношений в программы скрининга с использованием МС/МС анализа.

Выведенные соотношения для ДЦГАД и СЦАД не упоминаются в литературе, однако несмотря на небольшие выборки пациентов их информативность не вызывает сомнений и в случае получения пограничных значений основных маркеров, позволит избежать ложноотрицательных и ложноотрицательных результатов.

Подтверждающая диагностика

В рамках данного исследования дополнительно разработаны некоторые методы подтверждающей диагностики.

Определение активности биотинидазы

Активность биотинидазы в сыворотке крови определена у 18 пациентов и в 114 контрольных образцах. Диагноз недостаточность биотинидазы (НБ) установлен на основании клинических проявлений, а также подтвержден молекулярно-генетическими методами. В таблице 6 представлены средние значения активности фермента для пациентов с установленным диагнозом НБ и контрольной группы. Статистически достоверные (по критерию Ньюмена-Кейлса, уровень значимости р<0.05) различия между средними значениями активности фермента позволяют применять данный метод для подтверждающей биохимической диагностики НБ.

Высокоэффективная жидкостная хроматография - тандемная масс-спектрометрия.

Для дифференциальной диагностики тирозинемии тип 1, нарушений цикла мочевины и глутаровой ацидурии тип 1 разработаны методы определения сукцинилацетона, оротовой и глутаровой кислот в моче с помощью ВЭЖХ-МС/МС анализа (таблица 7). Методы, обладают высокой чувствительностью, большим диапазоном линейности и позволяют проводить исследование образцов мочи, собранных на карточку фильтр, что дает возможность упростить их транспортировку из удаленных регионов РФ в лабораторию.

Таблица 6. Итоговая таблица средних значений активности биотинидазы.

Таблица 7. Концентрации патологических метаболитов, определяемых с помощью ВЭЖХ-МС/МС

Газовая хроматография/масс-спектрометрия органических кислот мочи.

Подтверждающая диагностика большинства заболеваний из групп органических ацидурий и аминоацидопатий проведена с применением газовой хроматографии - масс-спетрометрии (ГХ/МС). Всем пациентам, у которых выявлены соответствующие изменения в спектре аминокислот и ацилкарнитинов, проведено данное исследование.

Cущественное повышение концентраций определенных органических кислот и ацилглицинов являлось основанием для окончательного подтверждения диагноза (таблица 8).

Молекулярно-генетическая характеристика заболеваний, выявленных в ходе исследования.

Хотя для большинства НБО в качестве основных подтверждающих тестов применяются биохимические методы, для некоторых заболеваний требуется проведение ДНК-диагностики. Особенно это актуально для нарушений окисления жирных кислот. Кроме того данные исследования необходимы в тех случаях, когда семья планирует проведение пренатальной диагностики. Также характеристика спектра мутаций при разных заболеваниях имеет самостоятельное научное значение, поскольку расширяет наши представления о генетическом многообразии и наши данные об особенностях разных популяций.

В ходе исследования разработаны простые и быстрые методы ДНК-диагностики для выявления частых мутаций при глутаровой ацидурии тип1, тирозинемии тип 1, недостаточности СЦАД и ДЦГАД (таблица 9).

Таблица 8. Значения концентраций диагностически значимых метаболитов в группе органических ацидурий.