[Введите текст]
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» (ФГБОУ ВПО «КубГУ») Кафедра генетики, микробиологии и биотехнологии
ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА БАКАЛАВРА
Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами
Работу выполнила А.Е. Клименко
Факультет биологический
Направление 06.03.01 Биология
Краснодар 2015
РЕФЕРАТ
Работа выполнена на 53 листах машинописного текста. Содержит 4 таблицы и 18 рисунков, включает 40 источников литературы.Ключевые слова: ИДЕНТИФИКАЦИЯ, МИЦЕЛИЙ, МАЛДИ, ВСЕРОССИЙСКАЯ КОЛЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПЦР, ШТАММ, ГЕН 16S рРНК, Секвенирование ДНК
Цель работы: выделение и идентификация чистых культур микроорганизмов, полученных из различных мест обитания, и их классификация в соответствии с современной филогенетической систематикой.
Объектом исследования служили 57 штаммов бактерий, их них 31 штамм микроорганизмов, отобранных при бурении скважины 3/09 в районе реки Средняя Чукочья Колымской низменности из образцов вечномерзлых отложений (возраст 1,8-2 млн. лет), 14 штаммов, выделенных в разные годы из почв Волгоградской, Курской, Московской, Оренбургской, Ростовской, Рязанской, Саратовской областей, Калмыкии, Мордовии, Краснодарского края, а также 12 штаммов кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии Кубанского государственного университета (г. Краснодара), выделенные из нефтезагрязненных грунтов.
Были выделены чистые культуры микроорганизмов, определены морфологические и культуральные признаки. Проведена идентификация методами МАЛДИ-МС и ПЦР с последующим секвенированием нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК.
На основании полученных результатов можно сказать, что данные штаммы относятся к классам Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacilli.
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Микроорганизмы играют огромную роль в природных процессах и в течение многих лет являются «полигоном», где современная наука исследует фундаментальные основы живой материи. Интерес к изучению и практическому использованию микроорганизмов, мир которых чрезвычайно многообразен и динамичен, непрерывно возрастает, особенно в последние десятилетия. На развитие данного направления оказывает существенное влияние наличие коллекционных штаммов микроорганизмов, постоянно поддерживаемых и изучаемых. Поэтому не случайно проблема долгосрочного хранения микроорганизмов без утраты их свойств признана первостепенной во всех странах мира.
Характеристика микробных сообществ разных мест обитания актуальна в связи с изучением биоразнообразия экосистем. В последние годы несомненный интерес вызывает изучение микрофлоры в многолетнемерзлых осадочных породах разного возраста и генезиса. Мёрзлые подпочвенные отложения и погребённые подкурганные почвы, которые рассматриваются как закрытые, а ранее активно функционирующие системы, являются природными резервуарами длительно (тыс. - млн. лет) законсервированных сообществ микроорганизмов, хранилищами древних генов и биомолекул [ Psychrophiles: from..., 2008; Margesin, Miteva, 2011]. Вечномёрзлые отложения широко распространены на Земле и могут рассматриваться как одна из её оболочек - криосфера.Коринеформные актинобактерии являются доминирующим компонентом культивируемой микрофлоры ряда исследованных образцов вечной мерзлоты и отмечалась тенденция к увеличению доли таких бактерий с увеличением возраста образца [Длительность сохранения…,1990].
Цель работы: выделение и идентификация чистых культур микроорганизмов, полученных из различных мест обитания, и их классификация в соответствии с современной филогенетической систематикой. микроорганизм генетический нуклеотидный ген
Исходя из поставленной цели данной работы, нами были обозначены следующие задачи:
· Определение морфологических и культуральных признаков исследуемых штаммов;
· Идентификация методам МАЛДИ масс - спектрометрии;
· Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК.
1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
1.1 Всероссийская коллекция микроорганизмов
Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМ) функционирует как центр сбора, изучения, поддержания и предоставления широкого спектра непатогенных микроорганизмов и информации о них для научных, образовательных, производственных и других учреждений. Фонд ВКМ является самым крупным в РФ по численности и таксономическому разнообразию поддерживаемых микроорганизмов и широко востребован специалистами различного профиля в связи с фундаментальными и прикладными исследованиями. Фонд содержит около 20000 тыс. штаммов разнообразию (более 3300 видов 750 родов) поддерживаемых культур на 2008 год микроорганизмов, представителей всех основных надцарств (бактерии, археи, грибы), выделенных из различных природных источников широкой географии. Фонд включает типовые (эталонные) штаммы видов, культуры пока не описанных новых таксонов, организмы с уникальными свойствами и биотехнологическим потенциалом.
Для гарантированного сохранения фонда используются азотные криохранилища и другое специализированное оборудование, обеспечивающее реализацию более 25 различных режимов консервации, известные и разработанные специалистами ВКМ оригинальные методы консервации, а также многолетний опыт специалистов разных поколений по их использованию [www.vkm.ru].
ВКМ сегодня располагает полным комплексом современных методов и оборудования, необходимых для точной идентификации микроорганизмов ( в том числе, на уровне вида), обнаружения и описания новых таксонов различных групп микроорганизмов (бактерии, археи, мицелиальные и дрожжевые грибы) в соответствии с международными стандартами. В числе новых методов ВКМ (2012) - метод МАЛДИ масс-спектрометрии.
Впервые метод описан во второй половине 80-х годов XX века [Karas, Bachmann, Hillenkamp, 1985]. Метод заключается в облучении короткими лазерными импульсами образца, представляющего собой твердый раствор анализируемого соединения в органической матрице. Матрица выбирается таким образом, чтобы ее молекулы активно поглощали фотоны, эмитируемые УФ- или ИК-лазером. Над поверхностью образца создается плотная высокотемпературная плазма, в которой наряду с молекулами и ионами матрицы оказываются и молекулы анализируемого соединения. Ионизация последних путем поглощения энергии фотонов или в результате ионно-молекулярных реакций приводит к образованию положительных и отрицательных ионов, которые вытягиваются высоким потенциалом из области ионизации и направляются в анализатор. Метод характеризуется интенсивными пиками молекулярных ионов разного типа и низкой фрагментацией. Наиболее термолабильные, труднолетучие, высокомолекулярные соединения стали доступны масс-спектрометрическому анализу. В современной науке МАЛДИ МС - основной аналитический метод в биохимии и химии полимеров [Лебедев, 2003].
Рисунок 1 - Взаимодействие лазерного импульса с образцом [Василюк, 2009]
Его достоинствами являются чувствительность (несколько фемтомолей (1 М-15)вещества)), простота пробоподготовки и экспрессность (анализ занимает несколько минут) [Fenselau, Demirev, 2001]. Несмотря на ряд факторов, оказывающих влияние на результаты анализа клеток бактерий с использованием МАЛДИ МС (например, условия культивирования), при оптимизации условий эксперимента, получаемые спектры отражают сходство (и родство) бактерий, в особенности на уровне «вид-штамм». Было показано, что наилучших результатов можно добиться, исследуя микроорганизмы в стационарной фазе роста [Monitoring the growth…, 1999].
1.2 Характеристика микроорганизмов, выделенных из многолетнемерзлых отложений
Криолитозона представляет собой лучший природный палеобанк биологических, геологических, экологических, климатических и других данных [Gilichinsky, Rivkina, Samarkin , 1993].Имеются сведения об обнаружении в многолетнемерзлых субстратах разного состава и возраста организмов класса Actinobacteria. Представители этого класса выделяются среди других прокариот высоким содержанием ГЦ-пар в ДНК (более 50%), сложной организацией и размерами генома (до 12 млн. п.о.) разнообразием морфологии клеток и жизненных циклов, химического состава клеточной оболочки [Goodfellow, O`Donnell, 1994; Gao & Gupta, 2012]. Актиномицеты превосходят другие группы организмов по способности синтезировать биологические активные соединения [Anderton & Wilkinson, 1980].Активно изучаются поверхностные слои биосферы на предмет обитания в них микроорганизмов [Bacterial recovery …,2003]. В криогенных образованиях (льды, вечномерзлые грунты и погребенных в них почвы) разного возраста (до 3 млн. лет) обнаружены в жизнеспособном состоянии различные микроорганизмы от неспороносных и спорообразующих бактерий до актиномицетов, микроводорослей, дрожжей и мицелиальных грибов [Длительность сохранения …, 1985; Количественная оценка …, 1990 ].
Микробиота глубоких слоёв биосферы и, особенно, вечной мерзлоты интересна также в качестве “банка древних генов”. Предполагается, что вечная мерзлота, особенно наиболее раннего геологического времени, представляет собой резервуар наиболее древних на земле «законсервированных» природных сообществ микроорганизмов.
1.3 Современное состояние систематики микроорганизмов
Систематика микроорганизмов - наука, изучающая разнообразие видов микроорганизмов и взаимоотношения между ними [Goodfellow, O`Donell, 1993]. Основной таксономической единицей бактериальной классификации является вид [Report of the …, 2002]. Вид - основная таксономическая категория в классификации любой группы организмов. Так как биологическая концепция вида неприменима к прокариотам, бактериальный вид обычно рассматривается как прагматическая категория, которая описывает генотипически обособленные группы индивидуальных изолятов/штаммов, характеризующихся высокой степенью сходства по многим независимым свойствам, определённым при стандартизированных условиях [Rassello-Mora & Amann, 2001; Report of the…, 2001].К одному виду обычно относят организмы, уровень ДНК сходства между которыми приблизительно 70% или выше [Report of the…, 2002]. Для прокариот и архей общепринятой является филогенетическая концепция вида. Из неё следует, что различные геновиды (т.е. группы штаммов, различаемые только на геномном уровне) не должны называться новыми видами до тех пор, пока не будут найдены фенотипические особенности, дифференцирующие их от описанных видов.
В настоящее время нет удовлетворительного филогенетического определения рода. Границы и критерии выделения родов могут отличаться для разных групп организмов [Murray, 1990; Rassello-Mora, Amann, 2001]. В случае, если уровень филогенетического сходства около 97% и выше, то организмы могут быть отнесены как к одному, так и к разным родам [Lechevalier, 1989].В последнее время классификация бактерий во всё большей степени основывается на данных геносистематики [Stackebrandt, Rainey, Ward-Rainey, 1997], способствующих переходу таксономических исследований на более высокий уровень. Современная систематика бактерий является полифазной, т.е. базируется на интегрированном использовании различной информации о микроорганизмах, полученной с помощью молекулярно-биологических, химических и нумерических методов [Евтушенко, 1996].
1.4 Генетические признаки бактерий
В настоящее время в систематике бактерий осуществляется пересмотр сложившихся представлений, который благодаря своему бурному характеру и значению происходящих перемен, справедливо называется революцией, её результатом является переход таксономических исследований на новый более высокий уровень [Goodfellow, Mordaski, Cross, 1989].
Нуклеотидный состав ДНК-первая характеристика генома, которая стала использоваться в систематике прокариот. Определение процентного содержания гуанина и цитозина в ДНК (моль % ГЦ) является частью обязательного стандартного описания бактериальных таксонов, в том числе и актиномицетов [Goodfellow, O`Donnell, 1994].
ДНК-ДНК гибридизация, этот метод всё ещё остается основным при определении видовой принадлежности штаммов прокариот. Данные, накопленные в течение нескольких десятилетий, показали высокую корреляцию между результатами ДНК-ДНК гибридизации и фенотипическими характеристиками [Stackebradt, Goebel, 1994]. Уровень ДНК - ДНК гибридизации свидетельствуют о степени, в которой одноцепочечные молекулы ДНК различного происхождения могут реассоциироваться в двойную цепь [Rossello-Mora, Amann, 2001].
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК продемонстрировал высокую степень разрешения этого метода при рассмотрении родства между организмами на надвидовом уровне. В первую очередь это связано с высокой консервативностью молекулы 16S рРНК. Данные по нуклеотидным последовательностям генов 16S рРНК практически всех представителей родов и большинства видов имеются в соответствующих базах данных - Рибосомальной Базе Данных (RDB II) и Национального Центра Биологической Информации (NCBI) [Stackebrandt, Goebel, 1994].