Дипломная работа: Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами

Для идентификации штаммов методом МАЛДИ (таблица 3) было взято 45 штаммов из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН и 12 штаммов из музея коллекционных культур кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии.

Таблица 3 - Результаты идентификации методом МАЛДИ масс-спектрометрии с использованием программы Biotyper 3.0 (Bruker).*

* В таблице представлены выборочные данные

** Штаммы с ненадежной идентификацией в таблицу не включены

Метод МАЛДИ масс - спектрометрии ориентирован на идентификацию патогенных и условно - патогенных микроорганизмов, поэтому почвенные бактерии и близкие им виды в базе данных МАЛДИ находятся в меньшем количестве. Именно поэтому многие штаммы не были идентифициованы этим методом.

На основании спектров (приложение А), полученных методом МАЛДИ масс-спектрометрии, из всех исследуемых штаммов удалось идентифицировать до вида 10 штаммов и до рода 23 штамма. Данные штаммы отнесены в соответствии с современной филогенетической систематикой [Bergey Manuales, 2007] к следующим таксонам:

3.70, 3.74 - Methylobacterium extorquens, порядок Rhizobiales, класс Alphaproteobacteria;

3.92 - Pseudomonas stutzeri, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria;

3.130 - Brevundimonas vesicularis, порядок Caulobacterales, класс Alphaproteobacteria;

№5 - Acinetobacter schindleri, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria;

3.15 - Bacillus Licheniformis, порядок Bacillales, класс Bacilli;

3.17 - Paenibacillus glucanolyticus, порядок Bacillales, класс Bacilli;

3.76 - Staphylococcus epidermidis, Bacillales, класс Bacilli;

3.127 - Bacillus firmus, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.128 - Providencia rettgeri, порядок Enterobacteriales, класс Gammaproteobacteria.

№1,№3, №7 - род Rhodococcus, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; К5 - род Gordonia, порядок Actinomycetales, род Gordonia, класс Actinobacteria;

К8 - род Dietzia, подпорядок Corynebacterineae, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria;

№2, №4, P20, РD4, 3.73, 3.92 - род Pseudomonas, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria ;

3.28 - род Roseomonas, порядок Rhodospirillales, класс Alphaproteobacteria;

3.59, 3.70, 3.74 - род Methylobacterium, порядок Rhizobiales, класс Alphaproteobacteria;

3.132, №5 - род Acinetobacter, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria;

3.15, 3.127 - род Bacillus, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.130 - Brevundimonas vesicularis, порядок Caulobacterales, класс Alphaproteobacteria;

3.17 - род Paenibacillus, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.76 - род Staphylococcus, Bacillales, класс Bacilli;

3.128 - род Providencia, порядок Enterobacteriales, класс Gammaproteobacteria.

Штаммы: 204, 205, 207, 210, 222, 223, 224, 250, 251, 3.16, 3.25, 3.26, 3.58, 3.93, 3.129, 3.131, 3.134, 3.135, №6, 8(Р9), не удалось идентифицировать методом МАЛДИ, поэтому для дальнейшей их идентификации был использован сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК (таблица 4). По финансовым соображениям этот метод не мог быть использован для всех неидентифицированных штаммов. В связи с этим были отобраны штаммы, представляющие возможность пополнения коллекций микроорганизмов ВКМ и КубГУ.

Таблица 4 - Уровни сходства по генам 16S рРНК исследуемых штаммов с ближайшими типовыми штаммами

Таким образом, все указанные (таблица 4) коллекционные штаммы были идентифицированы до рода по генетическим признакам.

На основании результатов, полученных при анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК (приложение Б) удалось систематизировать следующие штаммы: 3.16 - род Janibacter , порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; 3.25, 3.26, 3.135 - род Microbacterium, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; 3.58 - род Sphingomonas, класс Alphaproteobacteria; 3.93 - род Arthrobacter, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; 3.129, 3.131 - род Brevundimonas, порядок Caulobacterales, класс Alphaproteobacteria; 3.134 - Belnapia, порядок Rhodospirillales, класс Alphaproteobacteria; №6 - род Pseudomonas, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria, 8(P9) - род Bacilus, порядок Bacillales, класс Bacilli.

Все идентифицированные до вида или рода штаммы переданы в коллекции ВКМ и КубГУ. Штаммы с ненадежной идентификацией, но изученными морфолого-культуральными свойствами, отнесены к классам Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli и подлежат дальнейшему исследованию с целью их систематизации.

Во всех исследуемых образцах было обнаружено большое микробное разнообразие представителей различных видов и родов. Изоляты из колымской низменности были представленные в основном актиномицетами

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проделанной работы можно сделать следующие выводы:

1. На основании полученных морфологических и культуральных признаков микроорганизмов, выделенных из различных регионов России, все изоляты были отнесены к классам: Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacilli.

2. Из 57 штаммов методом МАЛДИ удалось идентифицировать 23 штамма до рода (Rhodococcus, Gordonia, Roseomonas , Dietzia, Pseudomonas, Methylobacterium, Bacillus, Brevundimonas, Acinetobacter, Paenibacillus, Staphylococcus, Providencia) и 10 штаммов до видов (Methylobacterium extorquens, Pseudomonas stutzeri, Brevundimonas vesicularis, Acinetobacter schindleri, Bacillus Licheniformis, Paenibacillus glucanolyticus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus firmus, Providencia rettgeri.)

3. С помощью анализа фрагментов гена 16S рРНК удалось установить следующие рода (Janibacter, Microbacterium, Sphingomonas, Arthrobacter, Brevundimonas, Belnapia, Pseudomonas, Bacilus).

4. Штаммы с ненадежной идентификацией, но изученными морфолого-культуральными свойствами, отнесены к классам Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli, Gammaproteobacteria и переданы в коллекции ВКМ и КубГУ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Василюк Н.В. Применение методов масс-спектрометрии для характеристики микроорганизмов.Установление путей биологической деструкции пиридина.Москва, 2009.С.67.

2 Евтушенко Л.И. Современная систематика актиномицетов и близких бактерий // Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрОРАН. - Пермь, 1996. С. 34-35.

3 Длительность сохранения микроорганизмов в постоянно мерзлых осадочных породах и погребенных почвах / Звягинцев Д.Г. [и др.] // Микобиология. 1985. Т.54. Вып. 1 . С. 155-161.

4 Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. М.:Бином. Лаборатория знаний. 2003. 493с.

5 Количественная оценка микроорганизмов многолетнемерзлых отложнениях и погребенных почвах / Хлебникова Г.М. [и др.] // Микробиология. 1990. Т.59. Вып. 1.С.148-155.

6 Сравнительная характеристика микробных сообществ многолетнемерзлых пород различного возраста и генезиса / Звягинцев Д.Г [и др.] // Микробиология . 1990. Т. 59. Вып.3. С. 491-498.

7 AFLP: a new technique for DNA fingerprinting / P. Vos [et al.] // Nucleic Acids Res. 1995. N23. P. 4407-4414.

8 Amplified polymorphic DNA PCR in the Microbiology Teaching Laboratory / J. Baker [et al.] // Biochim. And Mol. Biol. Education 2002. Vol. 30. N 6. P. 394-397.

9 Amplified-fragment length polymorphism analisis: the state of an art / P.H. Saveikoul [et al.] // J. Clin. Microbiol. 1999. N37. P.3083-3091.

10 Anderton,W.J & S.G. Wilkinson. Evidence for pretence of a new class of teichoic acids in the cell wall of bacterium NCTC9742 // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 118. P. 343-351.

11 Bacterial recovery from ancient glacial ice / Christner B.C [et al.] // Environmental microbiology. 2003. V. 5. P. 433-436.

12 Bergey`s Mannual of Systematic Bacteriology 2ed. 2007.

13 Box-PCR fingerprinting as a powerful Tool to reveal Synonymous Names in the Genus Streptomyces. Emended Descriptions are proposed for the species Streptomyces cinereorectus, S. frabiae, S. tricolor, S. colombiensis / B. Lanoot [et al.] // Syst. Appl. Microbiol. 2004. N27. P. 84-92.

14 Current protocols in Molecular Biology/ Ausubel F.M.//N.Y.: John Wiley and Sons. 1994.

15 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G. Williams [et al.] // Nucl. Acids Res. 1990. N18. P. 6531-6535.

16 Fenselau C., Demirev P.A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry // Mass Spectr. Rev. 2001. V.20, pp.157-171

17 Frank-Kamenetskii M.D. Simplification on the empirical relationship between melting temperature of DNA, its GC content and concentration of sodium ions in solution // Biopolymers. 1971. V.10, pp. 2623-2624.

18 Gao B. & Gupta R.S. Phylogenetic framework and molecular signatures for te main clades of the phylum Actinobacteris // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012. V. 76(1). P. 66-112.

19 Gilichinsky, D.A., and E.M. Rivkina, V.A. Samarkin. The microbiological and biogeochemical research in permafrost: Paleoecological implication // Proceeding of the 6 Int. Conf. on permafrost .1993. P. 869-874.

20 Goodfellow M. & O`Donnell A.G. Handbook of new bacterial systematic // London: Academic Press. 1993.

21 Goodfellow M. & O`Donnell A.G. Roots of bacterial systematic // In: Handbook of new bacterial systematic. 1994. P. 3-56.

22 Goodfellow M. The biology Actinomycetes / M. Goodfellow, M. Mordaski, T. Cross. // The biology of biology - Academic Press, London, 1984. P.7 - 164.

23 Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing / F.C. Tenover [et al.] // J.Clin. Microbiol. 1995. N33. P. 2233-2239.

24 Karas M., Bachmann D., Hillenkamp F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules.// Anal. Chem. 1985. V.57. P. 2935-2939.

25 Lechevalier H.A. A practical guide to genetic identification of actinomycetes. In: Bergey`s manual of systematic bacteriology. Edited by Williams S.T., Sharpe M.E., Holt J.G. // Baltimore: Williams and Wikins. 1989. V. 4, pp. 2344-2347.

26 Marmur J., Doty P. Determination of the dase composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation //J. Mol. Biol. 1962. V.5, pp.109-118.

27 Margesin R., Miteva V. Diversity and ecology of psychrophilic

28 microorganisms // Res. Microbiol., 2011, vol. 162, No. 3, p. 346-361.

29 Monitoring the growth of bacteria culture by MALDI-MS of whole cells / Arnold R.J[et al.] //Anal. Chem. 1999. V.71, pp.1990-1996.

30 Murray R.G.E. Report of the Ad Hoc Committee on Approches to Taxonomy within the Proteobacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1990. V. 40, pp. 213-215.

31 Olive D.M., Bean P. Principles and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms // J. Clin. Microbiol. 1999. N37. P. 1661-1669.

32 Owen R.J., Hill L.R., Lapage S.P. Determination of DNA base compositions from melting profiles in dilute buffers // Biopolymers. 1969. V.7, pp.503-516.

33 Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematic / P. Vandamme [et al] // Microbiol. Rev. 1996. N.60. P. 407-438.

34 Psychrophiles: from biodiversity to biotechnology / Gilichinsky D.A [et al] // 2008, p. 83-102.

35 Rassello-Mora R. & Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25. P. 39-67.

36 Report of the ad hoc committee for the revaluation of te species definition in bacteriology / Stackebrandt E [et al ] // Int. J. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 1043-1047.

37 Schildkraut C., Lifson S., Dependence of the melting temperature of DNA on the salt concentration // Biopolymers. 1965. V.3, pp.195-208.

38 Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA - DNA reassociation and 16S rRNA sequence analisis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V.44, pp.846 - 849.