Дипломная работа: Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами

Методы ДНК-типирования широко используются в различных областях микробиологии. Вместе с фенотипическими подходами, они направлены на выявление разнообразия среди близкородственных организмов в основном на уровне вид-подвид-штамм [Amplified-fragment length…, 1999].

Все методы генотипирования можно объединить в несколько групп. Первая включает методы и подходы, основанные на анализе фрагментов рестрикции целого генома - LFRFA (Low Frequency Restriction Fragment Analysis - анализ низкочастотных рестрикционных фрагментов) [Interpreting…,1995; Polyphasic taxonomy…, 1996].

Вторая группа методов генотипирования связана с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и включает:

Методы, основанные на амплификации ДНК с произвольными праймерами - это RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) [DNA polymorphisms…, 1990; Amplified polymorphic…, 2002].

Методы REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic sequence - повторяющиеся экстрагенные палиндромные последовательности) основаны на использовании праймеров, комплементарных консервативным повторяющимся последовательностям в ДНК. Эти последовательности рассеяны по геному бактерий [Olive, Bean, 1999; Box-PCR fingerprinting…, 2004].

Третья группа методов объединяет как ПЦР, так и рестрикционный анализ ДНК. Эти методы можно использовать для анализа рестрикционных фрагментов определенных генов - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorhpism - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК), генов 16S рРНК - ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis - рестрикционный анализ амплифицированных рибосомальных ДНК) [Vaneechoutte, 1996] или целого генома - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - полиформизм длины амплифицированных рестрикционных фрагментов ДНК) [AFLP: a new…, 1995].

Проведенные сравнительные исследования показали, что описанные методы генотипирования дают полезную информацию о штаммовых вариациях внутри видов [Ecology…, 2000].

Таким образом, современная систематика прокариот, располагается богатым и мощным арсеналом методов, используемых при решении широкого круга классификационных и идентификационных задач. Проблема заключается в выборе методов в зависимости от конкретных задач исследования, согласовании полученных данных и взвешенности таксономических предложений, сделанных на основе полученных результатов.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК продемонстрировал высокую степень разрешения этого метода при рассмотрении родства между организмами на надвидовом уровне. В первую очередь это связано с высокой консервативностью молекулы 16S рРНК. Данные по нуклеотидным последовательностям генов 16S рРНК практически всех представителей родов и большинства видов имеются в соответствующих базах данных - Рибосомальной Базе Данных (RDB II) и Национального Центра Биологической Информации (NCBI).

Методы генотипирования находят все более широкое применение в различных областях биологии, медицины, сельского хозяйства и биотехнологии вследствие и высокой разрешающей способности, простоты анализа, быстроты получения конечного результата, возможности автоматизации процесса, создания банков данных и др.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа проводилась на базе Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) им. Г.К. Скрябина РАН.

2.1 Объект исследования

Объектом исследования служил 31 штамм (204, 205, 207, 210, 222, 223, 224, 250, 251, 3.15, 3.16, 3.17, 3.25, 3.26, 3.28, 3.58, 3.59, 3.70, 3.74, 3.73, 3.76, 3.92, 3.93, 3.127, 3.128, 3.129, 3.130, 3.131, 3.132, 3.134, 3.135) микроорганизмов, отобранных при бурении скважины 3/09 в районе реки Средняя Чукочья Колымской низменности из образцов вечномерзлых отложений (возраст 1,8-2 млн. лет), 14 штаммов (38137, 38140, 38152, 38154, 38157, 38166, 38191, 38273, 38678, 38604, 38678, 38447, 38724, 41138), выделенных в разные годы из почв Волгоградской, Курской, Московской, Оренбургской, Ростовской, Рязанской, Саратовской областей, Калмыкии, Мордовии, Краснодарского края, а также 12 (№1, №3, №7, №6, 8(Р9), К5, К8, №4, Р20, PD4, №5, №2) штаммов кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии Кубанского государственного университета (г. Краснодара), выделенные из нефтезагрязненных грунтов.

Выбранные штаммы были взяты из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН и из музея коллекционных культур кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии, с целью перепроверки их таксономической принадлежности. Все изученные штаммы поддерживаются в ВКМ, включены в каталог ВКМ [www.vkm.ru], где представлена также их номенклатурная история.

2.2 Выделение чистых культур микроорганизмов

Штаммы, используемые в работе, находились в лиафилизированном состоянии. Лиофилизация ? процесс высушивания под вакуумом из замороженного состояния. Для выделения чистой культуры использовали плотную среду R2A, после чего осуществлялся смыв культур из ампул стерильной водой. Для посева на плотную питательную среду в чашках Петри небольшое количество материала набирали стерильной петлей и втирали в поверхность среды возле края чашки, далее использовался метод штриховых посевов. Инкубация проводилась при температуре 28С.

2.3 Морфологические и культуральные признаки

Морфологические и культуральные признаки изучаемых штаммов определяли, выращивая культуры на плотной среде (R2A агар) при температуре 28С. Форма клеток, размер и образование мицелия учитывались приготовлением препарата « раздавленная капля », выращенных на среде R2A в чашках Петри, при использовании светового микроскопа.

2.4 Среды и реактивы

Состав среды R2A (HiMedia) : пептон 0,5 г, казаминовые кислоты - 0,5 г, дрожжевой экстракт - 0,5г, растворимый крахмал - 0,5 г, пируват натрия - 0,3 г, K2HPO4 - 0,3 г, декстроза - 0,5 г, MgSO4 - 0,05 г, агар - 15 г, вода дист. -1 л, pH 7,2. Культуральные признаки изучали после инкубирования в течение 3-7 дней.

Cреда ВКМ №55: пептон - 2 г, дрожжевой экстракт - 1 г, MgSO₄Ч7H₂O - 0.2 г на 1 л дистиллированной воды. рH раствора доводили до 6.2-7.0 5М NaOH перед внесением агара (Difco) до конечной концентрации 1.5% [www.vkm.ru].

2.5 МАЛДИ масс-спектрометрия

Для анализа масс-спектральных белковых профилей культуры выращивали на среде R2A (28С,48 ч). Клетки (~ одну колонию) переносили с помощью тонкого стерильного шпателя на стальную пластинку-мишень, сверху наносили 0,7 мкл раствора матрицы (б-циано-4-гидроксикоричная кислота [HCCA] в 50%-ном водном растворе ацетонитрила, содержавшем 2.5% трифторуксусной кислоты) и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Спектры регистрировали в линейном режиме с задержанной экстракцией ионов на приборе “Autoflex Speed” (“Bruker Daltonics”). Время задержки - 350 нс, ускоряющее напряжение - 20 кВ.

Запись спектров проводили в режиме положительных ионов; диапазон регистрируемых масс составлял 2-20 кДа. Внешнюю калибровку прибора проводили по смеси белков “Bruker Bacterial Test Standard” (“Bruker Daltonics”); разрешение спектров составило ±2 Да (200 ppm). Результирующие спектры каждого препарата штаммов получали суммированием спектров, зарегистрированных в 10-15 точках анализируемых препаратов при 500 ударах лазера.

Обработку масс-спектров производили с помощью программных пакетов “Flex analysis 3.3” и “Biotyper 3.0” (“Bruker Daltonics”). Использовались параметры оценки значения.

Таблица 1 - Оценка значения

2.6 Выделение и очистка ДНК

Выделение и очистку ДНК проводили методом по (Current protocols in, 1994). Для проведении ПЦР культуры выращивали в пробирках на среде ВКМ №55 при температуре 28 єС в течение 48 ч. В пробирку с чистой культурой вносили 1 мл буфера ТЕ[Трис-HCl - 10мМ, ЭДТА - 1мМ, pH 8.0, H₂O], не вынимая пипетку перемешивали. Полученную суспензию клеток микроорганизмов помещали в пробирку типа «Eppendorf» на 1.5 мл, далее добавляли лизоцими оставляли на час при температуре 37 єС в твердотельном термостате «Гном» («ДНК-Технология»). Затем ресуспендировали 200 мкл в микроцентрифужную пробирку. Объем доводили до 280 мкл буфером ТЕ. Добавляли 7 мкл 20%-ого SDS (sodium dodecyl sulfate, додецил сульфат натрия), выдерживали 1.5 ч при температуре 37 єС. Затем вносили 1.5 мкл фермента РНКазы А (10 мг/мл), выдерживали 1.5 ч при 37 єС, и 6 мкл фермента ПроК (протеиназа К) (10 мг/мл), выдерживали 1 ч при 37 єС. Добавляли 22 мкл 20%-ого SDS, оставляли на 15 мин при 55 єС. Добавляли 44 мкл 5М NaCl до конечной концентрации 0.7М и 36 мкл СТАВ, выдерживали 30 мин при 65 єС. Экстракцию проводили 400 мкл смеси фенол/хлороформа (1:1), перемешивали 5-10 мин до получения однородной эмульсии и центрифугировали при 14500 об/мин в течение 10 мин, затем отбирали верхнюю водную фазу в отдельную микроцентрифужную пробирку. Проводили экстракцию равным объмом хлороформа, также перемешивали в течение 5-10 минут и центрифугировали при 14500 об/мин 10 мин, отбирали верхнюю водную фазу. Осаждали ДНК 0.6V изопропилового спирта, промывали 70%-ым этанолом два раза (по 700 мкл) в течние 2 ч и один раз 150 мкл 96%-ого этанола в течение 5-10 мин.

2.7 Амплификация фрагментов генов 16S рРНК

ПЦР проводили в ДНК-амплификаторе «Gene Amp PCR System 9700» («Applied Biosystems», США) с использованием бактериальных праймеров: прямого 27F и обратного 1492R. Реакционная смесь из расчета на 25 мкл содержала: 2,5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера для Taq ДНК-полимеразы («Fermentas», Литва); 2.5 мкл дНТФ; 1.5 мкл MgCl₂ ( 25 мМ); 0.5 мкл праймера 27F (10 pM); 0.5 мкл праймера 1492R (10 pM); 1 мкл Taq ДНК-полимеразы LC («Fermentas», Литва); 1 мкл геномной ДНК; 15.5 мкл деионизированной H₂O. ПЦР проводили в следующем режиме: предварительная денатурация при 95єС 5 минут; 30 циклов: денатурация при 94єС 30 сек; отжиг при 55єС 30 сек; синтез при 72єС 1 мин 20 сек; конечная элонгация при 72єС 4 минуты. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1%-м агарозном геле с добавлением флюоресцирующего красителя - бромистого этидия - в электрофорезной камере «Bio - Rad» в однократном ТВЕ буфере [ Трис-HCI-89 мМ, борная кислота - 89 мМ, ЭДТА - 2 мМ, pH 8.3, H₂O] в течение 20 мин. Разделение фрагментов ДНК контролировали с помощью УФ-трансиллюминатора.

2.8 Определение нуклеотидного состава ДНК

Нуклеотидный состав ДНК определяли методом тепловой денатурации (Marmur, Doty, 1962) с использованием спектрофотометра «Beckman DU800» («Beckman Coulter»), снабженным термостатирующим устройством. В качестве буферного раствора применяли 0.1Ч SSC. Концентрацию ДНК доводили до ~25 мкг/мл (ОD₂₆₀ 0.2-0.5). Откачивали воздух 15 мин вакуумным насосом. Измеряли температуру плавления при длине волны 260 нм в 1-см кварцевых кюветах с герметичными крышками и термопарой (фиксирующей температуру). Устанавливали температуру 25⁰С и регистрировали поглощение в опытной кювете против контрольной с растворителем. Температуру медленно повышали (0.5^0С/мин) и проводили постоянную регистрацию изменения поглощения. Значение температуры, дающее 50%-ное увеличение поглощения, соответствовало значению температуры плавления (Т_m) для данной ДНК. Нуклеотидный состав ДНК рассчитывали по формуле (Frank-Kamenetskii, 1971; Owen et al., 1969; Schildkraut, Lifson, 1965): ГЦ, мол% = 2.08Т_m - 106.4.

2.9 Определение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК

Для амплификации фрагментов генов 16S рРНК использовали универсальные эубактериальные праймеры: прямой 27F и обратный 1525R. Очистку ПЦР-продукта проводили с применением GeneJET^TM Gel Extraction Kit #K0691, #K0692 («Fermentas», Литва). Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе «CEQ2000 XL» («Beckman Coulter», США) в соответствии с предлагаемой фирмой инструкцией.

3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОЛЛЕКЦИОННЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ СОВРЕМЕННЫМИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМИ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

В работе было использовано 45 (204, 205, 207, 210, 222, 223, 224, 250, 251, 3.15, 3.16, 3.17, 3.25, 3.26, 3.28, 3.58, 3.59, 3.70, 3.74, 3.73, 3.76, 3.92, 3.93, 3.127, 3.128, 3.129, 3.130, 3.131, 3.132, 3.134, 3.135, 38137, 38140, 38152, 38154, 38157, 38166, 38191, 38273, 38678, 38604, 38678, 38447, 38724, 41138) штаммов из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН и 12 (№1, №3, №7, №6, 8(Р9), К5, К8, №4, Р20, PD4, №5, №2) штаммов из музея коллекционных культур кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии. Были изучены культуральные и морфологические признаки, получены МАЛДИ масс-спектры и определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S рРНК.

У всех 57 штаммов изучены морфологические и культуральные признаки (таблица 2).

Таблица 2 - Морфологическая и культуральная характеристика штаммов