Автореферат: Использование технологии дезоксирибонуклеиновой кислоты для оценки воспроизводительных качеств свиней

Анализ локуса гена ESR. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров ESR-F: 5/-CCCTCTATGACCTGCTGCTG-3/ и ESR-R: 5/-TCAGATTGTGGTGGGGAAGTTC-3/, подобранных Kamiсski S.et al. (Kamiсski S. Simultaneous identification of ryanodine receptor 1 (RYR1) and estrogene receptor (ESR) genotypes with the multiplex PCR-RFLP method in Polish Large White and Polish Landrace pigs // J. Appl. Genet. 2002. V. 43 (3). P. 331-335) для амплификации фрагмента гена ESR длиной 185 п.о. Для определения аллельного полиморфизма гена ESR по вариантам M и W 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Ama87I в 1Чбуфере «W» фирмы СибЭнзим (Россия) при 370C в течение ночи. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 3% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1ЧТВЕ буфере.

Анализ локуса гена RYR1. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров:

1) Ryr1-p-f: 5/-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA-3/ и Ryr1-p-r: 5/-TTCACCGGA GTGGAGTCTCTGAGT-3/, подобранных Riojas-Valdes V.M. et al. (Riojas-Valdes V.M. et al. Allele frequency of porcine stress syndrome in Nuevo Leon by PCR-RFLP analysis // Vet. Mexico. 2005. V. 36. № 003. P. 261-267) для амплификации фрагмента гена RYR1 длиной 659 п.о. Для определения аллельного полиморфизма гена RYR1 по вариантам N и n 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 2 ед. эндонуклеазы рестрикции Bbv12I в 1Чбуфере «О» фирмы СибЭнзим (Россия) при 370C в течение ночи.

2) RYR1-F: 5/-CCACACCCTCCCCGCAAGTGC-3/ и RYR1-R: 5/-GCCAGGGA GCAAGTTCTCAGTAAT-3/, подобранных Luerce T.D. et al. (Luerce T.D. et al. An improved method for characterization of the mutation associated to porcine stress syndrome by PCR amplification followed by restriction analysis // Ciкncia Rural, Santa Maria. 2009. V. 39. N. 5. Р. 1577-1580) для амплификации фрагмента гена RYR1 длиной 144 п.о. Для определения аллельного полиморфизма гена RYR1 по вариантам N и n 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции HspAI в 1Чбуфере «Y» фирмы СибЭнзим (Россия) при 370C в течение ночи. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5-4% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1ЧТВЕ буфере.

Анализ локуса гена H-FABP. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров H-FABP-F: 5/-ATTGCTTCGGTGTGTTTGAG-3/ и H-FABP-R: 5/-TCAGGAATGGGAGTTATTGG-3/, подобранных Li C.L. et al. (Li C.L. et al. Polymorphism of the H-FABP, MC4R and ADD1 genes in the Meishan and four other pig population in China // South African J. of Animal Sci. 2006. V. 36. N. 1.P. 1-6) для амплификации фрагмента гена H-FABP длиной 800 п.о. Для определения аллельного полиморфизма гена H-FABP по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции HaeIII в 1Чбуфере «G» фирмы СибЭнзим (Россия) при 370C в течение ночи. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1ЧТВЕ буфере.

Анализ локуса гена MC4R. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров MC4R-F: 5/-TACCCTG ACCATCTTGATTG-3/ и MC4R-R: 5/-ATAGCAACAGATGATCTCTTTG-3/, подобранных Li C.L. et al. (Там же, С. 2) для амплификации фрагмента гена MC4R длиной 226 п.о. Для определения аллельного полиморфизма гена MC4R по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 20 ед. эндонуклеазы рестрикции TagI в 1Чбуфере «W» фирмы СибЭнзим (Россия) при 65 0C в течение ночи. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1ЧТВЕ буфере.

Частоту встречаемости генотипов RYR1, PRLR, ESR, H-FABP, MC4R определяли по формуле: р = n : N, где р - частота определения генотипа, n - количество особей, имеющих определенный генотип, N - число особей. Частоту отдельных аллелей определяли по формулам: pA = (2nAA+nAB) : 2N и qB = (2nBB+nAB) : 2N, где pA - частота аллеля A, qB - частота аллеля B, N - общее число аллелей.

Ожидаемые и наблюдаемые частоты генотипов в исследуемых популяциях свиноматок крупной белой породы подсобного хозяйства «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Агро» рассчитывали по закону Харди-Вайнберга (Петухов В.Л. и др. Ветеринария генетика с основами вариационной статистики. М.: Агропромиздат. 1996. 243 с).

Воспроизводительные качества основных свиноматок крупной белой породы с разными генотипами и комбинациями генотипов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, MC4R оценивали по таким показателям: общее количество родившихся поросят в среднем на 1 свиноматку, количество живых родившихся поросят в среднем на 1 свиноматку и процент мертворождённых поросят.

Полученные результаты исследований обрабатывались биометрическим методом с применением вариационно-статистического анализа (Меркурьева Е.К. Биометрия в селекции и генетике с.-х. животных. М.: Колос. 1970. 424 с). Достоверность полученных данных определяли по критерию Стьюдента.

2.2 Результаты собственных исследований

2.2.1 Апробация аммиачного и комбинированного щелочного способов выделения ДНК из крови свиней

ДНК из крови свиней выделяли аммиачным и комбинированным щелочным способами, предложенные Вафиным Р.Р. в 2006 году и усовершенствованные способы экстракции ДНК из крови крупного рогатого скота группой исследователей Вафиным Р.Р., Ахметовым Т.М., Валиулллиной Э.Ф., Зариповым О.Г., Тюлькиным С.В.

Выделенные нами образцы ДНК из крови свиней как аммиачным, так и комбинированным щелочным способами показали их возможность использования в ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по генам PRLR, ESR, RYR1, H-FABP и MC4R.

2.2.2 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену PRLR

Для оценки качества работы известного протокола по генотипированию свиней по гену PRLR нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: PRLR1 и PRLR2, подобранных Linville R.C.et al. (Linville R.C. et al. Candidate gene analysis for loci affecting litter size and ovulation rate in swine. P. 62) по усовершенствованной нами технике ПЦР-ПДРФ. Праймеры PRLR1+PRLR2 инициируют амплификацию фрагмента гена PRLR свиней длиной 161 bp, а ПДРФ-AluI профиль (AA=126/35 bp, BB=91/35 bp и AB=126/91/35 bp) идентифицирует его генотипы (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена PRLR с праймерами PRLR1+PRLR2 и эндонуклеазным расщеплением ферментом AluI

Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим); 1-2) генотип АА (126/35 bp); 3-4) генотип ВВ (91/35 bp); 5-6) генотип АВ (126/91/35), 7) цельный ПЦР-продукт гена PRLR (161 bp).

Полученные результаты ПЦР гена PRLR свиней с праймерами PRLR1+PRLR2 и в дальнейшем проведение ПДРФ являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

2.2.3 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену ESR

Для оценки качества работы известного протокола по генотипированию свиней по гену ESR нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: ESR-F: 5/-CCCTCTATGACCTGCTGCTG-3/ и ESR-R: 5/-TCAGATTGTGGTGGGGAAGTTC-3/, подобранных Kamiсski S. et al. (Kamiсski S. Simultaneous identification of ryanodine receptor 1 (RYR1) and estrogene receptor (ESR) genotypes with the multiplex PCR-RFLP method in Polish Large White and Polish Landrace. P. 332) по усовершенствованной нами технике ПЦР и ПЦР-ПДРФ. Праймеры ESR-F+ESR-R инициируют амплификацию фрагмента гена ESR свиней длиной 185 bp, а ПДРФ - Ama87I профиль (MM=76/62/47 bp, WW=109/76 bp и MW=109/76/62/47 bp) идентифицирует его генотипы (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена ESR с праймерами

ESR-F+ESR-R и эндонуклеазным расщеплением ферментом Ama87I

Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим); 1-2) генотип MM (76/62/47 bp); 3-4) генотип MW (109/76/62/47); 5-6) генотип WW (109/76 bp); 7) цельный ПЦР-продукт гена ESR (185 bp).

Полученные результаты ПЦР гена ESR свиней с праймерами ESR-F+ESR-R и в дальнейшем проведение ПДРФ являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

2.2.4 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену RYR1

Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию свиней по гену RYR1 нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: Ryr1-p-f и Ryr1-p-r, подобранных Riojas-Valdes V.M. et al. (Riojas-Valdes V.M. et al. Allele frequency of porcine stress syndrome in Nuevo Leon by PCR-RFLP analysis // Vet. Mexico. 2005. V. 36. № 003. P. 263-264); RYR1-F и RYR1-R, подобранных Luerce T.D. et al. (Luerce T.D. et al. An improved method for characterization of the mutation associated to porcine stress syndrome by PCR amplification followed by restriction analysis. Р. 1578) по усовершенствованной нами технике ПЦР и ПЦР-ПДРФ. Праймеры Ryr1-p-f+Ryr1-p-r инициируют амплификацию фрагмента гена RYR1 свиней длиной 659 bp, а RYR1-ПДРФ-Bbv12I профиль NN=524/135 bp (здоровые особи), Nn=524/358/166/135 bp (особи-носители мутации, рис. 3) nn=358/166/135 bp (больные особи) идентифицирует его генотипы.

Рис. 3. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена RYR1 с праймерами Ryr1-p-f+Ryr1-p-r и эндонуклеазным расщеплением ферментом Bbv12I

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим); 1, 2) генотип NN (524/135 bp); 3, 4) генотип Nn (524/358/166/135 bp); 5) цельный ПЦР-фрагмент гена RYR 1 (659 bp).

Праймеры RYR1-F+RYR1-R инициируют амплификацию фрагмента гена RYR1 свиней длиной 144 bp, а RYR1-ПДРФ-HspAI-профиль здоровых животных = 102/42 bp (генотип NN) (рисунок 4), больных животных = 144 bp (генотип nn), а животных-носителей мутантного аллеля n гена RYR1 =144/102/42 bp.

Рис. 4. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена RYR1 с праймерами RYR1-F+RYR1-R и эндонуклеазным расщеплением HspAI

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 bp (СибЭнзим); 1-17) генотип NN (102/42 bp); 18) цельный ПЦР-фрагмент гена RYR1 (144 bp).

Полученные результаты ПЦР гена RYR1 свиней с праймерами Ryr1-p-f+Ryr1-p-r, RYR1-F+RYR1-R и в дальнейшем проведение ПДРФ также являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

2.2.5 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену H-FABP

Для оценки качества работы известного протокола по генотипированию свиней по гену H-FABP нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров H-FABP-F и H-FABP-R, подобранных Li C.L. et al. (C.L. Li, Y.C. Pan, H. Meng Polymorphism of the H-FABP, MC4R and ADD1 genes in the Meishan and four other pig population in China. P. 2) по усовершенствованной нами технике ПЦР и ПЦР-ПДРФ. Праймеры H-FABP-F+H-FABP-R инициируют амплификацию фрагмента гена H-FABP свиней длиной 800 bp, а ПДРФ-HaeIII профиль (АА=683/117 bp, ВВ=405/278/117 bp и АВ=683/405/278/117 bp) идентифицирует его генотипы (рис. 5).

Рис. 5. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена H-FABP с праймерами H-FABP-F+H-FABP-R и эндонуклеазным расщеплением ферментом HaeIII

Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим); 1) генотип ВВ (405/278/117 bp); 2-3, 6-9, 11) генотип АВ (683/405/278/117 bp); 4-5, 10, 12) генотип АА (683/117), 13) цельный ПЦР-продукт гена H-FABP (800 bp).

Полученные результаты ПЦР гена H-FABP свиней с праймерами H-FABP-F+H-FABP-R и в дальнейшем проведение ПДРФ являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

2.2.6 Совершенствование техники ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по гену MC4R

Для оценки качества работы известного протокола по генотипированию свиней по гену MC4R нами была протестирована серия олигонуклеотидных праймеров: MC4R-F и MC4R-R, подобранных Li C.L. et al. (C.L. Li, Y.C. Pan, H. Meng Polymorphism of the H-FABP, MC4R and ADD1 genes in the Meishan and four other pig population in China. P. 2) по усовершенствованной нами технике ПЦР и ПЦР-ПДРФ. Праймеры MC4R-F+MC4R-R инициируют амплификацию фрагмента гена MC4R свиней длиной 226 bp, а ПДРФ-TaqI профиль (АА=226 bp, ВВ=156/70 bp и АВ=226/156/70 bp) идентифицирует его генотипы (рис. 6).

Рис. 6. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена MC4R с праймерами

MC4R-F+MC4R-R и эндонуклеазным расщеплением ферментом TaqI

Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим); 1-2, 5, 7-8, 11) генотип ВВ (156/70 bp); 3-4) генотип АА (226 bp); 6, 9-10, 12-13) генотип АВ (226/156/70); 14) цельный ПЦР-продукт гена MC4R (226 bp).

Полученные результаты ПЦР гена MC4R свиней с праймерами MC4R-F+MC4R-R и в дальнейшем проведение ПДРФ являются удовлетворительными в плане воспроизводимости и идентификации генотипов.

2.2.7 Аллельный полиморфизм гена PRLR у свиноматок

После проведении ПЦР-анализа в подсобном хозяйстве «Новая Тура» 100 основных свиноматок крупной белой породы распределение свиноматок по генотипам локуса гена PRLR было следующим: 61 (61,0%) свиноматка имела генотип АА, 32 (32,0%) - генотип АВ и всего 7 (7,0%) свиноматок - генотип ВВ. Частота аллеля А достигла 0,77, аллеля В - 0,32 (табл. 1). Несколько другая встречаемость генотипов и аллелей гена PRLR была среди 87 основных свиноматок крупной белой породы в ООО «ТАТМИТ Агро». Наибольшее количество животных было с генотипом АВ - 39 (44,8%) свиноматок, а наименьшее количество с генотипом АА - 23 (26,5%). Промежуточное местоположение занимали свиноматки с генотипом ВВ, количество которых составило 25 (28,7%) животных. При этом частота аллеля А была на уровне 0,49, аллеля В - 0,51.

Таблица 1 - Частота встречаемости генотипов и аллелей гена PRLR у свиней

Н - наблюдаемая частота генотипов, О - ожидаемая частота генотипов

Анализ фактического и теоретического распределения генотипов по локусу гена PRLR в двух популяциях свиноматок крупной белой породы показал, что разница между генотипами (АА, АВ и ВВ) незначительная и составила 2,0-4,6%. При этом показатель вариабельности хи-квадрат (ч2) у свиней крупной белой породы в двух стадах был в пределах от 0,32 до 0,56, что ниже табличных значений. Поэтому полученные данные говорят о том, что генное равновесие по гену PRLR не нарушено.