На правах рукописи
06.02.07 - Разведение, селекция и генетика
сельскохозяйственных животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК - ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫХ КАЧЕСТВ СВИНЕЙ
Нургалиев Фаннур Мударисович
Казань - 2013
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Ахметов Тахир Мунавирович
Официальные оппоненты: Мухаметгалиев Нурвахит Нургалиевич, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», заведующий кафедрой кормления с.-х. животных
Фаизов Тагир Хадиевич, доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, главный научный сотрудник научно - инновационного центра
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ижевская государственная сельскохозяйственная академия»
Защита диссертации состоится « » декабря 2013 г. на заседании диссертационного совета Д.220.034.02 при ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» по адресу: 420029, г. Казань, Сибирский тракт, 35; тел. (8432) 73-96-17.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», автореферат размещен в сети интернет на сайтах http: //www.vak.ed.gov.ru/ и //www.ksavm.senet.ru/
Автореферат разослан « » ноября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Гильмутдинов Рустам Якубович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Свиноводство - динамично развивающаяся отрасль животноводства, однако, как показывает мировой опыт, дальнейшее повышение эффективности отрасли невозможно без внедрения в селекционную работу достижений в области молекулярной генетики, в частности, нахождения генетических маркеров, отвечающих за определённые показатели продуктивности (Каспирович Д.А. Влияние полиморфизма генов - рецепторов EPOR, MUC4, IGF-2 на основные селекционируемые признаки свиней белорусской крупной белой и белорусской мясной пород: автореф. дис. канд. с.-х. наук: 06.02.07. Гродно. 2010. 20 с).
Новые открытия в молекулярной генетике позволяют выделять и изучать специальные участки генома, которые влияют на важные продуктивные, в частности на воспроизводительные признаки.
В качестве маркеров плодовитости свиней рассматриваются следующие гены, которые признаны генами-кандидатами, влияющими на размер гнезда, это ген эстрогенового рецептора - ESR и ген пролактинового рецептора - PRLR (Лобан Н.А. и др. Молекулярная генная диагностика в свиноводстве Беларуси. Дубровицы. ВИЖ. 2005. С. 34-37; Шейко И.П. и др. Селекция на повышение многоплодия свиноматок крупной белой породы методом молекулярной генной диагностики // Весцi нацыянальнай акадэмii навук Бэларусi. 2006. № 3. С. 77-81).
Потребители и перерабатывающая промышленность нуждаются в улучшении качества мяса. Это требует от селекционеров использования новых методов генетической селекции, направленных на усовершенствование продуктивных признаков. Данные, полученные из литературных источников, показывают потенциальную значимость генов белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP), рианодинового рецептора (RYR1) и меланокортиного рецептора 4 (MC4R) в качестве маркеров мясной и откормочной продуктивности (Лобан Н.А., Василюк О.Я. Карта генетического профиля свиней белорусской крупной белой породы // Вестник Белорусской Государственной Сельскохозяйственной Академии. 2010. № 2. С. 116-121; Гетманцева Л.В. Степень влияния гена МС4R на фенотип организма. Тезисы докладов XVIII Международ. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2011». М:. 2011. С. 89).
Некоторые исследователи, такие как Рыжова Н.В. (Рыжова Н.В. Полиморфизм гена RYR1 в популяциях свиней мясных пород: дис. канд. биол. наук: 06.02.01 Лесные Поляны. 2001. 107 с), Гришина Н.Б. (Гришина Н.Б. Использование генетических маркеров в селекции свиней крупной белой породы в Сибири: дис. канд. биол. наук: 06.02.01. Новосибирск. 2008. 147 с), Плужникова О.В. (Плужникова О.В. Естественная резистентность, воспроизводительные и мясные качества свиней в связи с их аллельным состоянием по локусу RYR-1 гена: автореф. дис. канд. биол. наук: 06.02.01. Ставрополь. 2009. 19 с) отмечают, что разные аллели и генотипы по локусу генов RYR1 и H-FABP наряду с непосредственным влиянием на откормочную и мясную продуктивность, оказывают некоторое действие на репродуктивные качества свиней.
Степень разработанности темы. Изучением генетической структуры по ДНК -маркерам в стадах свиней разных пород занимались многие, в том числе Банникова А.Д., Бублик Е.М., Лаломова Е.В., Kmiec M. et al., Vincent A.L. et al. - по гену PRLR; Банникова А.Д., Бублик Е.М., Зиновьева Н.А. и др., Костенко С.А. и др., Полозюк О.Н., Korach K.S. - по гену ESR; Кузнецов А.И. и др., Fujii J. et al., Mac Lennan D.H. et al., Смирнов Н.Н. по гену RYR1; Зиновьева Н.А. и др., Лобан Н.А. и др., Максимов Г.В. и др., Gerbens F. et al. по гену H-FABP; Бублик Е.М., Гетманцева Л.В., Костюнина О.В., Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И. и др., Шейко и др., Gantz I. et al. по гену МС4R. Однако в научных трудах этих учёных не имеется данных по генотипированию свиней методами ДНК-технологии в условиях Республики Татарстан. Не изучен аллельный полиморфизм генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP и МС4R у свиней разных пород, разводимых в Республике Татарстан.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы- исследование полиморфизма генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP и МС4R c помощью ДНК-диагностики у свиноматок крупной белой породы, а также определение влияния разных генотипов и их комбинаций на воспроизводительные качества животных.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- апробировать технику выделения ДНК из крови свиней для генно-молекулярных исследований;
- совершенствовать технику проведения ПЦР, ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP и МС4R; генный свинья белый воспроизводительный
- изучить частоту встречаемости аллелей, генотипов по локусам генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, МС4R и их комбинаций PRLR / ESR, PRLR / ESR / RYR1 / H-FABP / МС4R у свиноматок крупной белой породы;
- оценить воспроизводительные качества свиноматок крупной белой породы с разными генотипами по локусам генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, МС4R и их комбинаций PRLR / ESR, PRLR / ESR / RYR1 / H-FABP / МС4R;
- определить экономическую эффективность использования свиней крупной белой породы с разными комбинациями генотипов PRLR / ESR / RYR1 / H-FABP / МС4R.
Научная новизна работы. Усовершенствованы протоколы постановки ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, МС4R. Впервые в условиях Республики Татарстан изучен полиморфизм и определена частота встречаемости генотипов по локусам генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, МС4R и их комбинаций PRLR / ESR, PRLR / ESR / RYR1 / H-FABP / МС4R у свиноматок крупной белой породы. Изучены воспроизводительные качества свиноматок крупной белой породы с разными генотипами по локусам генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, МС4R и их комбинаций PRLR / ESR, PRLR / ESR / RYR1 / H-FABP / МС4R.
Теоретическая и практическая значимость. Основные положения и выводы диссертации позволяют пополнить теоретические данные, касающиеся селекции свиней методами ДНК-технологии.
Апробированные методы экстракции ДНК из крови свиней и усовершенствованные протоколы постановки ПЦР и ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, МС4R позволяют результативно их использовать в генно-молекулярных исследованиях и в частности в скрининге перечисленных генов. Полученные результаты исследований, касающихся генотипов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, МС4R и их комбинаций, возможно, использовать в свиноводстве для улучшения хозяйственно-полезных признаков, в том числе репродуктивных качеств свиней.
Методология и методы исследования. Основой диссертационного исследования выступает комплекс общенаучных и специальных методов. Для получения результатов исследования использовались общенаучные методы: аналогии, синтеза, индукции, дедукции (обеспечивающие, прежде всего теоретическую составляющую) и наблюдения, сравнения, моделирования (обеспечивающие, прежде всего практическую составляющую). Наряду с этим применялись специальные методы, в систему которых входили зоотехнические и методы генно-молекулярной диагностики. Для расчёта количественных показателей использовали математический и статистический методы. Применение перечисленных методов позволило получить объективные и достоверные результаты исследования.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность исследования подтверждается использованием комплекса методов и программ, что, в конечном счёте, выражается согласованностью полученных выводов и результатов исследования.
Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных отчётах кафедры технологии животноводства ФГБОУ ВПО КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2011-2013 гг.); научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГБОУ ВПО КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2012-2013 гг.); конкурсе пятьдесят лучших инновационных идей для Республики Татарстан (Казань, 2011-2012 гг.); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК» (Казань, 2012); республиканском конкурсе научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии имени Н.И. Лобачевского (Казань, 2012); всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и учащейся молодёжи (Казань, 2013); международной научно-практической конференции «Научное и кадровое обеспечение инновационного развития АПК», посвящённой 140-летию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2013).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 8 научных статей в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Основные положения, выносимые на защиту.
- Апробированные нами способы выделения геномной высокомолекулярной ДНК из крови свиней и усовершенствованные протоколы постановки ПЦР, ПЦР-ПДРФ для генотипирования свиней по локусам генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, МС4R позволяет точно определять аллели и генотипы, связанные у животных с хозяйственно-полезными признаками.
- Определена частота встречаемости генотипов и комбинаций генотипов генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, МС4R у свиноматок крупной белой породы в условиях Республики Татарстан.
- Выявлены желательные генотипы в стадах свиней крупной белой породы повышающие их репродуктивные качества.
- Экономически обосновано исследовать свиней крупной белой породы по локусам генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP, МС4R.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 24 таблицы, 31 рисунок. Состоит из: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, заключения, выводов, предложения производству, списка использованной литературы (всего 152 источника, в том числе 72 иностранных) и 15 приложений.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
2.1 Материалы и методы исследования
Исследования по теме диссертационной работы проводились в период с 2011 по 2013 гг. на кафедре технологии животноводства ФГБОУ ВПО «Казанская государственный академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», в отделе вирусологии и генно-молекулярной диагностики ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория», в подсобном хозяйстве «Новая Тура» Зеленодольского района и ООО «Алтын Саба» Сабинского района, которое было реорганизовано и вошло в состав новой фирмы ООО «ТАТМИТ Агро» Сабинского района Республики Татарстан. Научно-хозяйственные опыты поставлены согласно схеме исследования (рисунок 1).
Рисунок 1 - Схема исследования
Для определения полиморфизма генов пролактинового рецептора (PRLR), эстрогенового рецептора (ESR), белка, связывающего жирные кислоты (H-FABP), рианодинового рецептора (RYR1) и меланокортиного рецептора 4 (MC4R), оценки воспроизводительных качеств свиней с разными генотипами PRLR, ESR, RYR1, H-FABP и MC4R было отобрано в подсобном хозяйстве «Новая Тура», ООО «ТАТМИТ Агро» 100 и 87 основных свиноматок крупной белой породы. Определение аллельного полиморфизма генов PRLR, ESR, RYR1, H-FABP и MC4R осуществляли методами ДНК-технологии (метод ПЦР и ПЦР-ПДРФ).
По принципу аналогов (Овсянников А.И. Основы опытного дела в животноводстве. М.: Колос. 1976. 303 с) были сформированы группы из основных свиноматок крупной белой породы с разными генотипами PRLR, ESR, RYR1, H-FABP и MC4R, а также с разными комбинациями соответствующих генотипов.
При проведении научно-хозяйственных опытов использовали документацию зоотехнического и племенного учёта подсобного хозяйства «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Агро».
В подсобном хозяйстве «Новая Тура» и ООО «ТАТМИТ Агро» рационы кормления свиноматок были составлены с учётом норм и рационов кормления сельскохозяйственных животных (Калашников А.П. и др. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. Справочное пособие. 3-е изд. перераб. и допол. М.: 2003. 456 с).
Кровь отбирали из яремной вены свиней в вакуумные пробирки с ЭДТА. Выделение ДНК из крови свиней проводили аммиачным и комбинированным щелочным способом.
Анализ локуса гена PRLR. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с использованием праймеров PRLR1: 5/-СGGCCGCAGAATCCTGCTTGC-3/ и PRLR2: 5/-ACCCCACCTTGTAACCCATCATCC-3/, подобранных Linville R.C. et al. (Linville R.C. et al. Candidate gene analysis for loci affecting litter size and ovulation rate in swine // J. Anim. Sci. 2001. V. 79. P. 60-67) для амплификации фрагмента гена PRLR длиной 161 п.н. Для определения аллельного полиморфизма гена PRLR по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 2 ед. эндонуклеазы рестрикции AluI в 1Чбуфере «Y» фирмы СибЭнзим (Россия) при 370C в течение ночи. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 3% агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1ЧТВЕ буфере.