стью НАДФН-оксидазы, проявляют слабую бактерицидную способность. Кроме того, супероксидный радикал участвует в реакции Фентона, восстановление трехвалентного железа в двухвалентное ведет к генерации ОНрадикала, очень реакционно агрессивного. Ксантиноксидаза представляет собой интересный фермент, участвующий в механизмах регуляции многих процессов жизнедеятельности клетки. В нормальных условиях находится преимущественно в дегидрогеназной форме и может обратимо или необратимо переходить в оксидазную, что наблюдается, в частности, при ишемии или гипоксии. Необратимая активация ксантиноксидазы – пусковой механизм направления клетки на апоптозную гибель.
Супероксидный радикал генерируется также в митохондриях при транспорте электронов по дыхательной цепи ферментов. В частности, генерация осуществляется в ходе окисления↔восстановления убихинона (Q :
QH2 + O2 → QH• + H+ + O2-•;
QH• + O2-• → Q + H+ + O2-•.
В восстановленном состоянии убихинон является антиоксидантом, нейтрализуя супероксидный анион:
2 O2-• + QH2 → H2O2 + O2 + Q + 2 ē.
Для регуляции уровня генерации супероксидного радикала служит супероксиддисмутаза (СОД), фермент антиоксидантной защиты. Молекулярная масса СОД – 31 тыс. Да. Существует несколько изоферментных форм СОД: медь-, цинк-; марганец-; железосодержащие супероксиддисмутазы. Медь- и цинксодержащие СОД локализованы в цитоплазме и межмембранном пространстве митохондрий у эукариотов, чувствительны к цианиду. Марганецсодержащая СОД – цианрезистентна, локализована в матриксе митохондрий и встречается у бактерий, хотя для них более характерна железосодержащая СОД. Экзоцеллюлярная СОД существует в виде профермента с молекулярной массой около 150 тыс. Да. СОД осуществляет реакцию:
O2-• + O2-• + 2 Н+ → Н2О2 + О2 и инактивируется избытком перекиси водорода.
(2)Перекись водорода относится к окислителям средней силы. В отсутствие каталазы, глутатионпероксидазы или ионов металлов Н2О2 относительно стабильна и может мигрировать из клетки в межклеточное пространство и проникать в другие клетки. Источники перекиси водорода – оксидазы, переносящие 2 ē на молекулу кислорода: аминоксидазы, иногда ксантиноксидаза и супероксиддисмутаза. Около 80% перекиси водорода, генерируемой фагоцитами в очаге воспаления, образуется в супероксиддисмутазной реакции. Перекись водорода служит источником ОНрадикала, взаимодействуя с двухвалентным железом или другими метал-
166
лами переменной валентности. А также она является субстратом миелопероксидазы для образования высокореакционных гипогалоидов. Генерация перекиси водорода приводит к закислению среды в очаге воспаления и обусловливает гибель многих бактериальных клеток. Большинство эукариотических клеток устойчивы к перекиси водорода за счет присутствия разлагающих ее ферментов: каталазы; глутатионпероксидазы (ГПО); причем ГПО эффективно работает при малых концентрациях Н2О2 (высокая Кm), каталаза – при более высоких (низкая Km). Каталаза локализована в пероксисомах, а ГПО – в цитозоле и митохондриях. Они катализируют следующие реакции:
2Н2О2 → 2Н2О + О2
каталаза
2GSH + Н2О2→ GSSG + 2H2O
глутатионпероксидаза.
Глутатион (GSH) способен также взаимодействовать с другими перекисными соединениями, эффективно тормозя ПОЛ:
2GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O.
Гипогалоиды образуются при реакции перекиси водорода с галидами, катализируемой миелопероксидазой (МПО) нейтрофилов и пероксидазой эозинофилов. Ферменты отличаются по структуре и субстратной специфичности. Основным продуктом МПО является ОНСl-, пероксидазы эозинофилов – ОНBr-. Миелопероксидаза локализуется в гранулах нейтрофилов. Дегрануляция приводит к освобождению МПО и образованию гипогалоидов. Применение к продуктам миелопероксидазной реакции термина «активные формы кислорода» не совсем верно, так как это по сути активные формы галогенов, но активными кислородными метаболитами их называть можно. Гипогалоиды ингибируют α1-антитрипсин (ингибитор сериновых протеаз), что приводит к активации протеолиза. Также они активируют коллагеназу, что обусловливает разрушение экстрацеллюларного матрикса в местах воспаления, окисляют лейкотриены, иммуноглобулины, альбумин, могут индуцировать ПОЛ. При взаимодействии с белками окисляют сульфгидрильные группы, но все же их главный эффект связан с нейтрализацией ингибиторов протеингидролаз.
Гидроксильный радикал (ОН•). Наиболее реакционноспособен из всех АКМ. Может разрывать любую С-Н и С-С связь. Образование этого радикала идет в реакции Габера-Вейса:
О2-• + Н2О2 → ОН- + ОН• + О2.
167
В реакциях окисления арахидоновой кислоты, при макросомальном окислении жирных кислот также генерируется ОН-радикал. Однако основной источник этого агрессивного радикала – реакция Фентона:
ROOH + Fe2+ |
RO• + OH- + Fe3+ или |
НOOH + Fe2+ |
ОН- + OH- + Fe3+ |
Обратное восстановление Fe3+ возможно при взаимодействии с супероксидным радикалом: Fe3+ + О2-• → Fe2+ + О2, а также при реакциях с аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином.
Цитотоксическое и канцерогенное действие ионизирующих излучений на живые организмы напрямую связано с генерацией ОН-радикала
впроцессе радиолиза воды: Н2О → ОН• + Н+ + ē. Радикалы ОН• участвуют
вмикробицидном и цитотоксическом действии гранулоцитов, моноцитов, Т-лимфоцитов. Генерация ОН-радикалов существенно лимитируется наличием ионов железа. Данные радикалы повреждают многие клеточные структуры, индуцируют образование органических радикалов и запускают процессы ПОЛ. Специфических ферментов, превращающих ОН-радикалы, подобных СОД, нет. Защиту осуществляют в некоторой степени низкомолекулярные соединения: урацил, мочевая кислота, глюкоза, диметилсульфоксид и др.
Синглетное состояние кислорода. Основное состояние молекулярно-
го кислорода – триплетное. Изменение спина одного из электронов, находящихся на π-орбиталях в молекуле кислорода, приводит к образованию возбужденного синглетного состояния, энергия которого на 96,3 кДж/моль больше, чем энергия триплетного. Высокая реакционная способность синглетного кислорода ведет к тому, что он легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями, инициируя ПОЛ [9].
ПОЛ и его продукты в эволюционном плане представляют один из наиболее ранних регуляторных механизмов и выступают в роли первичного медиатора стрессовой ситуации. Образование АКМ – неотъемлемое звено существования высших форм живых организмов. Они принимают активное участие в деструкции тканей в ходе воспалительного процесса, образуются в результате активации фагоцитов, регулируют пролиферацию и гибель клеток, участвуют в поддержании тонуса сосудов. Производство АКМ служит главным регулятором процессов обмена, апоптоза клеток и организма, играет значительную роль в эволюционном процессе.
В1967 г. Р.Х. Мак Артур и Е.О. Уилсон выдвинули гипотезу о существовании в популяциях стратегий жизни двух типов: тип R предполагает бурное размножение и короткую продолжительность жизни; тип К – низкие темпы размножения и долгую жизнь. К-стратегия характерна для благоденствия популяции в уже захваченном ареале и в относительно стабильных условиях среды. Эволюционный процесс в такой популяции идет медленно. Изменение условий среды приводит к переключению на страте-
168
гию R, что сопровождается ускорением темпов размножения и жизни, сокращению продолжительности жизни. Что же лежит в основе выбора стратегии, каков механизм восприятия изменений условий жизни? В 1998 году Э.Мур получил трансгенное растение табака с повышенной экспрессией одного из генов, кодирующего шаперон mHsp70. Трансгенный табак был вдвое выше нормального, втрое увеличилось количество митохондрий в клетках и скорость процессов дыхания. Оказалось, что резкое повышение производства mHsp70 ускоряло импорт и фолдинг митохондриальных белков, ответственных за дыхание и фосфорилирование. Усиление дыхания и синтеза АТФ и стимулировало рост растения. Таким образом, суперпродукция mHsp70 может быть молекулярным механизмом переключения стратегий. Ухудшение условий среды существования организма приводит к усилению экспрессии mHsp70, активирует дыхательный процесс, что увеличивает производство АКМ. Повышенный выход АКМ способствует активации мутационного процесса, появлению большего генетического разнообразия и формированию приспособлений к изменившимся условиям среды. Однако ускорение производства АКМ способствует и более быстрому старению и гибели клеток и уменьшению продолжительности жизни организма [24].
Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз клеток
В организме в качестве физиологических индукторов апоптоза выступают цитокины и стероидные гормоны. Одна из главных причин развития окислительного стресса под действием стероидных гормонов – снижение уровня производства ферментов-антиоксидантов: каталазы, супероксиддисмутазы, а также уменьшение концентрации восстановленного глутатиона. К цитокинам – индукторам апоптоза – относят факторы некроза опухолей (ФНО) и интерлейкин 1β (ИЛ-1β). Интерлейкин1β в комбинации с интерфероном γ, ФНО активирует синтез NO-синтезы (NOS) и продукцию NO-радикалов. Эндогенные и экзогенные NOрадикалы индуцируют гибель макрофагов, β-клеток поджелудочной железы, гладкомышечных клеток, опухолевых клеток. В основе повреждающего действия радикала окиси азота лежит образование сильного окислителя – пероксинитрита:
O2-• + NO• → ONOO-.
Пероксинитрит способен окислять аминогруппы и тиоловые группы белков, индуцировать процессы переокисления липидов в мембранах, способствует образованию ОН-радикалов [10]:
2ONOO- + 2 H+ → ONOOH → OH• + NO2.
169
В присутствии пероксинитрита или продуктов его распада образуются радикалы глутатиона и инициируется ПОЛ. В то же время есть основания рассматривать процесс генерации окиси азота в нитратсинтазной системе клеток как фактор адаптационной защиты при гипоксических состояниях. Н.Н. Кургалюк и соавторы [14] показали, что особенности развития биоэнергетической гипоксии у животных с разной резистентностью к кислородной недостаточности определяются NO-зависимыми эффектами. Среди них NO-зависимое снижение интенсивности окисления, вызванное активацией холинергических мускариновых M2- и брадикиновых ВК2- рецепторов в скелетных мышцах.
Оксид азота выполняет роль и вторичного посредника, синтезируемого в клетках из L-аргинина под влиянием нитратсинтазы (NOS). Эффекты окиси азота реализуются через активацию растворимой гуанилатциклазы и синтеза другого вторичного посредника – цГМФ, что сопровождается блокированием фосфолипаз и входа кальция в клетку. Этим объясняются стресс-лимитирующие эффекты NO. Установление роли ацетилхолина как эндогенного вазоактивного регулятора, стимулирующего продукцию NO, показывает стратегию адаптационных изменений в условиях гипоксии. Основной физиологический эффект ацетилхолина состоит в экономизации поглощения кислорода и его использования тканями за счет переключения на «быстрый» цикл Кребса (повышение роли аминотрансферазных реакций) при стрессах и гипоксии. С установлением локализации NO-синтазы на внутренней мембране митохондрий были описаны прямые эффекты влияния окиси азота на функционирование дыхательной цепи. Прямое измерение продукции NO в интактных митохондриях подтвердило высказанную раньше гипотезу, что оксид азота, продуцируемый митохондриями, изменяет показатели дыхания и синтеза АТФ через ингибирование цитохромоксидазы (ЦО). Цитохромоксидаза осуществляет превращение оксида азота в нитрит- и нитратанионы. В настоящее время большое внимание привлекает возможная роль окиси азота как регулятора процессов дыхания в связи с тем, что митохондриальная нитратсинтаза располагается вблизи ЦО. Показано, что в условиях острой гипоксии активность ЦО повышается, она сохраняет способность к транспорту электронов на кислород даже при тяжелой гипоксии [16], когда выключается НАД-зависимое окисление субстратов и тормозится окисление на участке от цитохрома b к цитохрому с1. Ингибирование ЦО в этих условиях активирует цикл окиси азота. На роль сенсорных элементов, определяющих степень гипоксического влияния могут претендовать и другие гемсодержащие белки: гемоглобин, миоглобин, цитохром Р-450, переводя клетки на режим нитрат- но-нитритного дыхания в условиях дефицита кислорода [16].
Ускорение производства АКМ в условиях перехода от гипоксии к реоксигенации, инициация ПОЛ, разрушение мембран ведет к освобождению
170