Материал: Кленова Н.А. Биохимия патологических состояний

дикальных процессов в клетке. Поддержание оптимального функционирования митохондрий в условиях пониженного парциального давления кислорода может выступать одним из ведущих средств коррекции энергообеспечения клеток [23]. Согласно выдвинутой в 1985 году гипотезе о ней- ротрансмиттерно-субстратнонуклеотидных системах существуют прямые связи между рецепторным аппаратом и энергетическим обменом в клетках [6]. На уровне клеток работают две противоположно направленные системы: катехоламины – янтарная кислота – цАМФ – АТФ; ацетилхолин – α-кетоглутарат – цГМФ – ГТФ. Катехоламины усиливают образование и окисление сукцината, который аллостерически активирует сукцинатдегидрогеназу и моноаминоксидазу. Ацетилхолин наряду с торможением окисления сукцината активирует окисление α-кетоглутарата, проявляющего холиномиметический эффект. Последний связан с ингибированием ацетилхолинэстеразной активности при одновременном повышении содержания ацетилхолина в крови и тканях [6]. Указанная реципрокность обеспечивает клеткам возможность направленной регуляции эффективности митохондриального окислительного фосфорилирования в зависимости от энергетических и пластических потребностей клетки, а также коррекции гипоксического состояния [12].

Свободнорадикальные процессы. Окислительный стресс

Смещение баланса в сторону избыточной генерации свободных радикалов при дефиците антиоксидантов принято называть окислительным стрессом, который сопровождает гипоксические повреждения. Окисли-

тельный стресс и повреждение мембран. Кроме биохимических (высоко-

интегрированных, в несколькими уровнями регуляции) реакций, в клетках могут протекать и химические процессы. В основном источником химических превращений в клетках служат высокоагрессивные, реакционноспособные соединения, среди которых есть продукты метаболизма: мочевина, различные альдегиды, спирты, кетоны; промежуточные амфиболиты: аскорбиновая кислота, глутатион, токоферолы, гидрохиноны, филохиноны; основные метаболиты: глюкоза, фруктоза и их производные. Реакции, протекающие в клетках чисто химическим путем (без участия ферментов), получили название изнанки метаболизма и будут рассмотрены позже, в отдельном разделе. Весьма агрессивными в химическом отношении соединениями являются активные кислородные метаболиты (АКМ). Известно, что реакция восстановления кислорода до воды лежит в основе энергетики кислороддышащих организмов. Однако, наряду с сопряженным с дыханием окислительным фосфорилированием, в которое вовлекается 90% потребляемого кислорода, в клетках постоянно протекают реакции с образованием АКМ: супероксидного радикала (О2-), перекиси водорода (Н2О2), гидроксильного (НО•), хлоридного (НОCL•) и перекисного радикалов (RO2•).

161

Кислород в своем основном состоянии – бирадикал, два неспаренных электрона которого с параллельными спинами располагаются на разрыхляющих молекулярных π-орбиталях. Это делает его относительно инертной молекулой. Вместе с тем кислород активно взаимодействует с органическими радикалами, имеющими неспаренный электрон. Данная реакция имеет важное значение в живых организмах, запуская цепные процессы свободнорадикального окисления липидов, являющихся легко окисляемыми соединениями. Радикальные процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) протекают во всех клетках живых организмов, главным образом, в фосфолипидных структурах мембран.

В основе современного представления о механизмах ПОЛ лежит выдвинутая в 1887 году гипотеза А.Н.Баха о возможности непосредственного присоединения молекулярного кислорода к органическим молекулам с образованием гидроперекисей. Субстратом окисления в биологических системах являются, в первую очередь, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), входящие в состав триглицеридов и фосфолипидов. Как все цепные реакции, процессы ПОЛ делят на три фазы: зарождение цепей, развитие цепных реакций и обрыв цепей. Зарождение цепей начинается в результате образования свободного радикала окисляющегося соединения. Источником могут стать радикалы, образующиеся под действием ионизирующих излучений, УФ-излучений, озона, свободных радикалов дыма табака, свободных радикалов химических реакций, АМК и других воздействий. Первая фаза является узким местом всей цепной реакции, и от ее скорости зависит скорость всего ПОЛ. На следующей стадии свободные радикалы быстро взаимодействуют с кислородом, который выступает в качестве акцептора электронов. В результате такого взаимодействия образуется перекисный радикал RO2•. Очень важно, что в молекулах гидроперекисей линолевой, линоленовой и арахидоновой кислот может формироваться система сопряженных двойных связей. Последовательность реакций в случае линоленовой кислоты:

―СН2―СН═ СН―СН2―СН═ СН―СН2―

8 9 10 11 12 13 14

―СН2―СН― СН―СН2―СН― СН―СН2―

│ │ │ │

+ О2

―СН2―СН― СН═ СН―СН═ СН―СН2―

│

О―О―

162

Молекулы с двумя сопряженными двойными связями могут быть обнаружены спектрофотометрически с max поглощения λ233 нм. Они получили название диеновых конъюгатов и служат чувствительным тестом на обнаружение гидроперекисей ПНЖК. Поскольку диеновые конъюгаты появляются в сущности на стадии образования свободных радикалов (СР), то увеличение их количества говорит о ускорении их возникновения. Так как конъюгация может произойти примерно у 50% СР, образовавшихся из ПНЖК, теоретически отношение числа гидроперекисей к числу диеновых коньюгатов равно 2, что подтверждается и экспериментальными данными. Большая часть липидных гидроперекисей в биологических мембранах образуется из ПНЖК, находящихся в β-положении мембранных фосфолипидов. В качестве наиболее окисляемых жирнокислотных остатков выступают арахидоновая, линолевая и деказогексаеновая кислоты, расположенные в β-положении фосфатидилэтаноламина (ФЭА) и фосфатидилхолина (ФХ). Появление диеновых кетонов обусловлено реакцией дегидрирования гидроперекисей, количество диеновых кетонов можно зарегистрировать при

λ273 нм [13].

Возникающие в результате окисления органические перекиси могут включаться в процесс генерации радикалов в присутствии металлов переменной валентности, так как в этом случае наблюдается их разложение с образованием реакционного алкоксильного радикала:

Самой распространенной из подобных реакций является реакция Фентона, так как в клетках больше всего двухвалентного железа:

Двухвалентное железо в составе гемовых структур способно прочно связываться липидами биомембран, становясь центром радикалообразования. Кроме того, ионы железа участвуют еще в двух реакциях, приводящих к формированию радикалов:

163

Обрыв цепных реакций ПОЛ возможен также при взаимодействии с антиоксидантами: глутатионом, аскорбиновой кислотой, токоферолами, убихиноном, мочевой кислотой, билирубином и др. Тормозят свободнорадикальное окисление (СРО) и специальные ферментативные системы антирадикальной защиты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза).

ПОЛ как часть СРО имеет важное значение, так как служит сигналом к обновлению фосфолипидного бислоя мембран. Поэтому системы антиоксидазной защиты (АОЗ) направлены на поддержание ПОЛ на стационарном уровне. Недостаток антиоксидантов, действие внешних прооксидантов, а также активация эндогенного производства АКМ приводят к напряжению механизмов АОЗ и развитию окислительного стресса, который имеет проявления на клеточном, тканевом и организменном уровнях.

Производство АКМ в ферментативных реакциях. Активация кисло-

рода в биологических системах происходит прежде всего в оксидазных реакциях. В состав ферментов оксидаз входят металлы переменной валентности. В 1978 году был составлен первый каталог оксидаз, в который вошло 220 ферментов [9]. Все они представляют собой металлсодержащие протеиды, в состав функциональных доменов которых входят железо, медь, цинк, молибден, марганец, кобальт. По строению активного центра их делят на пять основных классов.

(1)Определяющее состояние кислорода – О2. Сюда относятся гемопротеиды, не являющиеся ферментами: гемоглобин, миоглобин, гемоэритрин, гемоцианин. Окисления металла при выполнении функции обычно не происходит.

(2)Определяющее состояние кислорода – О2- (ксантиноксидаза. НАДФН-оксидаза). Реакция окисления субстрата происходит по схеме: ХН2 + О2 → Х + О2- + 2Н+.

(3)Преобладающее состояние кислорода – О22- (аминоксидазы, ката-

лаза, пероксидазы, супероксиддисмутаза). Осуществляют перенос двух электронов на кислород: ХН2 + О2 → Х + Н2О2.

(4)Перенос четырех электронов, разрыв связи –О-О- и образование двух молекул воды (цитохромоксидаза; аскорбатоксидаза):

2ХН2 + + О2 → 2Х + 2Н2О.

(5)Преобладающее состояние кислорода – О23-, что также приводит к разрыву –О-О- связи и образованию воды, а также О•, который обычно встраивается в субстрат окисления по схеме:

Х + О2 + АН2 → ХО + Н2О + А (циклооксигеназа, липоксигеназа и цитохромы Р-450) [9].

Таким образом, все оксидазы (включая неферментативные гемопротеиды, транспортирующие кислород) в определенных условиях способны генерировать АКМ, которые могут утилизироваться системами АОЗ или обусловливать неферментативное ПОЛ. Часть же оксигеназ, суб-

164

стратами которых служат жирные кислоты, активируют как ферментативное, так и неферментативное ПОЛ. Циклооксигеназа окисляет жирные кислоты до циклических эндоперекисей, запускающих производство как свободных радикалов неферментативным путем, так и образование простагландинов, простациклинов, тромбоксанов в соответствующих ферментных комплексах. Цитохромы Р-450 гидроксилируют и эпоксилируют жирные кислоты и различные ксенобиотики, липоксигеназы окисляют жирные кислоты по двойным связям, внося перекисный радикал, превращая их в лейкотриены. Активация производства АКМ лежит в основе не только процессов обновления фосфолипидного бислоя мембран, но и апоптозной и некрозной гибели клеток, защитной функции нейтрофилов [10].

Характеристика основных форм активных кислородных метаболитов

(1) Супероксидный анион-радикал О2-. Супероксидный радикал более реакционноспособен, чем О2, характеризуется наличием неспаренного электрона, в водных растворах присоединяет протон и переходит в форму НО2•, являющуюся слабой кислотой. Время жизни в биологических субстратах – 10-6с. В виде супероксида имеет заряд и плохо проходит через мембрану, служит слабым окислителем, может стать и донором электронов, восстанавливая ряд соединений. Супероксидный анион является промежуточным продуктом во многих биохимических реакциях: окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, в метаболизме ксенобиотиков. Основные источники: ферментативные системы НАДФНоксидаз, ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-с-оксидаза и микросомальная система монооксигеназ.

Рассмотрим некоторые ферментативные системы производства супер-

оксида и их функции. Миелопероксидазная система нейтрофилов. Дан-

ная система представляет собой НАДФН-оксидазный ферментативный комплекс, восстанавливающий кислород до супероксида. Комплекс мембраносвязан, состоит по меньшей мере из трех компонентов: ФАДпротеид; цитохром-в558 и убихинона. При активации НАДФН-оксидазы происходит самосборка ферментативного комплекса, осуществляющего перенос электронов с цитозольного НАДФН на О2:

НАДФН → ФАД-Е → убихинон → Цитохром-в558 → О2 →

О2-• + О2-• → Н2О2 → + Cl- (Br-; I-; SCN-) → НОСl; HOBr; HOI; HOSCN CОД МПО

СОД – супероксиддисмутаза; МПО – миелопероксидаза.

Таким образом, генерация супероксид-аниона является пусковым механизмом образования Н2О2 и других реакционноспособных цитотоксических радикалов. Фагоцитирующие клетки, обладающие низкой активно-

165