Дипломная (вкр): Оценка метанолутилизирующей активности биопрепарата экологического назначения для очистки окружающей среды от метанола

Устранение в воздухе: Согласно модели декомпозиции газа/частиц полулетучих органических соединений в атмосфере, метанол, давление пара которого составляет 127 мм рт.ст. при температуре 25°C, будет существовать в окружающей атмосфере исключительно в виде пара. Парообразный метанол разлагается в ней благодаря реакции с гидроксильными радикалами фотохимического происхождения; полупериод данной реакции в воздухе, определенный на основании постоянной ее скорости, равной 9,4X10-13 см./молекула-сек. При температуре 25°C, составляет 17 дней.

Порядок утилизации:

Перед утилизацией метанола ознакомьтесь со всеми федеральными, региональными, государственными или местными нормативными актами. Допускается утилизация путем контролируемого сжигания или безопасного захоронения. По мере возможности подвергайте метанол переработке. Значительные его количества пригодны для вторичной перегонки или, в случае загрязнения - для сожжения. Метанол может утилизироваться и на очистных сооружениях. При концентрации, равной 0,1%, он служит питательной средой для бактерий. Однако в случае превышения указанного уровня может быть токсичен для микроорганизмов. При прокачке через систему канализационных коллекторов необходимо поддерживать уровень метанола ниже уровня огнеопасности (25-процентная водно-метаноловая смесь не воспламеняется при температуре ниже 39°C). 1 промилле метанола эквивалентна 1,5 промилле БПК-нагрузки на очистных установках. [17-23]

1.3.   Метилотрофия

Метилотрофия - это специализированный тип питания микроорганизмов, растущих на восстановленных одноуглеродных (С1) соединениях, или соединениях с несколькими С-атомами, но не имеющими C-C связи. Cпектр C1-соединений биогенного и абиогенного происхождения достаточно широк и включает около 50 наименований: от предельно восстановленного СН4 до предельно окисленного СО2, среди которых моноокись углерода, муравьиная кислота, диметиловый эфир, метилированные амины, галометаны, метилсульфид, метилсульфоксиды, тиоцианаты и др. Многие из этих летучих соединений обладают цитотоксическим и даже канцерогенным действием, а также ответственны за так называемый парниковый эффект, поскольку истощают озоновый слой атмосферы. Аэробные метилотрофы, использующие восстановленные C1-соединения, усваивают их одновременно в качестве источника углерода и энергии, выполняют уникальную функцию природного биофильтра на пути их эмиссии в атмосферу. Жизненно важная роль аэробных метилотрофов, осуществляющих трансформацию и деградацию C1-соединеннй, является причиной большого интереса, проявляемого мировым научным сообществом к исследованию разнообразия, особенностей метаболизма и физиологии этих микроорганизмов, занимающих промежуточное положение между типичными автотрофами и гетеротрофами [24-33].

Несмотря на структурную простоту, C1-соединения существенно различаются по физико-химическим свойствам, что, в свою очередь, определяет особенности биологии и метаболизма метилотрофных микроорганизмов. В принципе, все C1-соединення являются окисленными или замещенными производными метана. В зависимости от того, какая группировка (радикал) ассоциирована с C1-атомом, пути метаболизма этих соединений значительно различаются. Так, метанол, метилированные амины и формальдегид могут иметь до пяти путей катаболизма [33-45].

Метилсодержащие соединения (серин, глицин, биотин, холин, бетаин, метионин, триптофан, гистидин, лигнин, тимин, никотин и др.) являются центраболитами при синтезе многих полиуглеродных соединений (рис. 3). В центре их превращений те самые C1-единицы (метильные, метиленовые, оксиметильные и формальные группировки), которые участвуют в метаболизме Cn-соединений. Таким образом, мы видим, что C1-фрагменты очень важны метаболически для существования всего живого, поэтому использующие их метилотрофные микроорганизмы представляют значительный интерес как в плане изучения особенностей биологии, так и в целях практического применения [24, 36-80].

Способность к метилотрофии встречается как у прокариотных, так и эукариотных микроорганизмов. Среди аэробных эукариот известны 3 рода метанол использующих дрожжей: Hansenula, Candida и Pichia. В свою очередь, прокариоты (бактерии) разделены на две большие группы: одни растут на метане (метанотрофы), другие используют в качестве субстратов окисленные или замещенные производные метана, но не растут на метане (метилобактерии) [7-72].

Рисунок 3. Метаболические превращения с участием «активных» С1-фрагментов

В связи с тем, что метан и метанол являются возобновляемыми субстратами, их доступность и относительная дешевизна создали реальные предпосылки для использования аэробных метилотрофов в биотехнологических процессах. Второе обстоятельство, позволяющее активно применять метилотрофные микроорганизмы в биотехнологии - хорошая изученность их метаболизма. Третье важное обстоятельство - метилотрофынепатогенны [25-29].

Метилотрофы используются в качестве биокаталитических агентов для получения ферментов и генетической трансформации, для аналитических целей как биосенсоры, для синтеза моно- и полимеров (полигидроксибутирата. полисахаридов, каротиноидов, различных биопротекторов и др.), а также для биодеградации токсичных C1- и Cn-поллютаитов или биоремедиации окружающей среды. Список соединений и продуктов, которые можно синтезировать с помощью аэробных метилотрофов, постоянно пополняется новыми наименованиями. Таким образом, аэробные метилотрофы можно с полным основанием считать идеальными и перспективными объектами современной биотехнологии для целей биокатализа, биосинтеза и биоремедиации [29-34].

Следует особо отметить, что аэробные метилотрофы не имеют себе равных в микробном мире по филогенетическому и физиолого-биохимическому разнообразию. По мере расшифровки их структурно-функциональных особенностей становится все более очевидным, что аэробные метилотрофы являются одним из важнейших первичных звеньев в трофической цепи нашей планеты.

Метанотрофы и метилобактерии в биотехнологии.

Метилотрофы являются весьма неоднородной группой микроорганизмов, которые обладают большим количеством специализированных генов/ферментов, обеспечивающих рост на более восстановленных, чем С02, субстратах, не имеющих C-C связи. Вследствие физиолого-биохимических особенностей, разные метилотрофы реализуют разные метаболические возможности, что следует принимать во внимание при рассмотрении вопроса об их применении в биотехнологических процессах. Наибольшие выходы биомассы и скорости роста получены для метилотрофов с РМФ-путем ассимиляции формальдегида, в отличие от метилотрофов с сериновым циклом, включающим энергоемкие реакции карбоксилирования [24-37].

Скорости роста и метаболическая эффективность превращения субстратов в биомассу и/или продукт зависят от условий культивирования и могут быть улучшены с помощью инженерии. Они являются важными критериями для оценки основных технологических показателей того или иного микроорганизма в промышленных масштабах. Как и в случае других микробиологических процесссов, ключевыми вопросами при использовании метилотрофов являются скорости синтеза продуктов (производительность), выход (эффективность преобразования углерода) и концентрация продукта.

Для окисления 1 г метанола требуется 0.85 г кислорода, при этом выделяется 0,52 г С02. Оптимальные скорости роста для накопления биомассы можно получить путем поддержания низкой и стабильной концентрации метанола, поскольку более высокие концентрации и внезапные ее сдвиги оказывают токсичное действие на бактерии в связи с накоплением формальдегида. Кроме того, метаболизм метанола должен тщательно регулироваться для обеспечения большей толерантности культуры и скорости потребления. Это удалось достигнуть увеличением числа копий генов ГФС и ФГИ у факультативного метилотрофа В. Methanoticus. [35].

Типичные продукты биотехнологических процессов с участием метилотрофов - полигидроксиалканоаты и аминокислоты. Первые примеры метаболической инженерии метилобактерий в производстве лизина уже известны. Повышение синтеза лизина достигнуто за счет гетерологичной экспрессии в Methylophilusmethylotrophus устойчивых к ретроингибированию биосинтетических ферментов из Е. соli, либо экспортера аминокислот изCorynebaeteriumglulamicum [80].

Другими продуктами являются ЭПС, ИУК, трансзеатин, а также различные белки, такие как зеленый флуоресцирующий белок (GFP), энтероцин П, ациламидгидролаза, галоалкандегалогеназа и эстераза. М.

Для синтеза специфических продуктов разработаны специальные методы культивирования с целью повышения уровня целевого продукта. Например, общая стратегия синтеза ПГБ - это двухстадийный процесс, разделенный на фазу наращивания биомассы и фазу накопления биополимера, последняя индуцируется лимитированием по азоту. С помощью этой стратегии были достигнуты высокие уровни биомассы (130 г/л) и ПГБ (до 60%) [62-80].

Биосинтез кормового белка. Промышленные процессы с использованием метилотрофных бактерий были созданы с целью получения больших количеств белка одноклеточных (SCP) для питания людей и животных.

Масштабное промышленное производство кормового белка (гаприна) из природного газа с использованием термотолерантного штамма А/с. capsulatus 874 было реализовано в СССР в середине 1980-х гг.

Экзополисахариды (ЭПС). Многие метанотрофы родов Methylomonas, Methylococcus и Methylomierobium, а также метилобактерии родов Methylobacillus, Methylophilus,Methylophaga и Xanthobacter, реализующие РМФ- или РБФ- пути C1-метаболизма, синтезируют ЭПС из метана или метанола, причем выход ЭПС можно регулировать факторами среды и условиями культивирования [24-37].

Цитохромы, Пигменты (каротиноиды, меланин). Метилобактерии синтезируют пигменты, наиболее обычными из которых являются каротиноиды, придающие культурам розовый цвет. Термофильные метанотрофы рода Methylocaldum образуют меланиновый пигмент при понижении температуры культивирования до 42°С. В случае необходимости синтез этих пигментов можно интенсифицировать, варьируя дозы физико-химических факторов (pH, температуру, р02).

Бнодеградация токсичных соединений. Перспективность аэробных метилотрофов в биотехнологии обусловлена не только способностью синтезировать различные полезные продукты, довольствуясь минимальными, в сравнении с гетеротрофами, питательными потребностями, но и разлагать широкий спектр токсичных соединений.

Природа конечных продуктов биодеградации важна для экологии производства. Аэробные метилотрофы способны утилизировать вещества наиболее полно и без нежелательных побочных продуктов. Существенное значение имеют условия наработки биомассы для сорбции в биореакторе на носителе. Метилотрофы хорошо растут на простых минеральных средах, активно атакуют поллютанты. Иммобилизованные клетки метилотрофовобеспечивают полную конверсию ряда токсичных соединений в проточных условиях, что открывает перспективы широкого использования для целей биодеградации и биоремедиации.

1.4.   Специализированный биопрепараты

Биопрепараты и их получение.

Среди биопрепаратов, разработанных для решения задач охраны окружающей среды, можно выделить следующие группы по их назначению:

для ликвидации загрязнений;

для рекультивации территорий и восстановления плодородия почв;

для переработки отходов;

для очистки природных водоемов;

для биомониторинга и биотестирования.

В России биопрепаратами называют препараты, полученные на основе штаммов микроорганизмов, имеющих разрешения санитарно-эпидемиологических служб на их производство и применение. Подавляющее большинство этих штаммов прототрофные, природного происхождения, т. е. не относятся к генетически модифицированным и не содержат мутаций, требующих дополнительных источников ростовых факторов.

Выпускаемые коммерческие биопрепараты, предназначенные для очистки природных сред, представляют в основном массу жизнеспособных клеток микроорганизмов-биодеструкторов. Они различаются используемыми для их получения штаммами, имеющими различные физиолого-биохимические свойства, такие как термотолерантность, осмофильность, оптимальные для роста значения pH, способность включать в метаболические процессы разные классы загрязнений. Этифизиолого-биохимические свойства штаммов биодеструкторов определяют эффективность применения биопрепаратов в разных почвенно-климатических зонах и средах, для удаления различных по химическому составу загрязнений. Конечным продуктом биотрансформации загрязнений являются простые минеральные вещества и микробная биомасса, которая в природных условиях легко вовлекается в биогеохимические циклы превращения веществ.

Препараты для очистки природных сред должны отвечать ряду требований:

быть получены на основе непатогенных штаммов, выделенных из природных ценозов или селекционированных в лаборатории; не содержать патогенных инфицирующих микроорганизмов;

микроорганизмы биопрепаратов должны иметь высокие технологические показатели: способность к росту и накоплению биомассы в промышленных ферментерах больших объемов; высокая конкурентоспособность по отношению к сопутствующей микрофлоре ферментера, позволяющая проводить процесс в не строго асептических условиях; сохранение жизнеспособности при высушивании и длительном хранении;

быть технически простыми в использовании и экономически приемлемыми;

обеспечивать эффективное снижение уровня загрязнения без образования опасных промежуточных и конечных продуктов трансформации и не оказывать неблагоприятного воздействия на окружающую среду;

дозы препаратов, интродуцированных в окружающую среду, должны активировать самоочищающую способность природных биоценозов, не разрушать их структуру и функции, не стимулировать рост патогенных микроорганизмов.

Исследования по получению биопрепаратов направлены на подбор культур продуцентов, выбор форм препаратов, разработку технологии их применения.

В лабораторных условиях определяется активность отобранных штаммов по отношению к углеводородам разных групп и конкретного загрязнения, определяются оптимальные условия для проявления деструкционного потенциала микроорганизмов в почве, получают оценочные значения расходных норм препарата и возможной продолжительности очистки конкретного места загрязнения.

Для наработки препарата в производственных условиях разрабатывают технологический регламент, обеспечивающий получение продукта, соответствующего техническим условиям, сопутствующие рабочие инструкции по эксплуатации оборудования, микробиологическому контролю и т. п., разрабатываются рекомендации, инструкции по применению препарата.

Товарной формой препаратов могут быть сухой порошок и жидкая концентрированная суспензия клеток.

Технология получения сухих товарных форм биопрепаратов включает следующие стадии:

прием, хранение и подготовка сырья, органического субстрата, растворов минеральных солей;

обеспечение ферментационного процесса источником кислорода, технологической водой, паром, моющими и дезинфицирующими средствами, пеногасителями;

выращивание посевного материала;

накопление биомассы в рабочем аппарате - ферментере;

концентрирование суспензии микроорганизмов сепарацией, микрофильтрацией, адсорбцией на инертных материалах-наполнителях;

сушка;

если предусмотрено, гранулирование, компаундирование препарата с различными наполнителями и внесение добавок;

расфасовка, упаковка, складирование, отправка готового продукта;

очистка сточных вод, газовоздушных выбросов со стадии ферментации, сепарации и сушки.

На стадии ферментации микроорганизмы культивируют периодическим или непрерывным способом, на питательных субстратах и при режимах, гарантирующих получение микроорганизмов с необходимыми свойствами или активностью ферментов, участвующих в удалении загрязнений. При использовании таких субстратов, как углеводороды, биодоступные аналоги ксенобиотиков (например, нехлорированные аналоги хлорсодержащих соединений) возможно культивирование в не строго асептических условиях, что существенно упрощает требования к технологическому обеспечению ферментационного процесса и квалификации обслуживающего персонала.

При концентрировании биомассы и сушке используются методы и технологические режимы, обеспечивающие сохранение жизнеспособных клеток микроорганизмов, что особенно важно при получении биопрепаратов на основе неспоровых форм микроорганизмов. В частности, сепараторы и циркуляционные контуры мембранных установок оснащаются рубашкой для охлаждения суспензии, что позволяет в процессе сепарирования поддерживать температуру ниже температуры инактивации клеток микроорганизмов, для сушки применяют распылительные, лиофильные или вакуум-термические сушилки.